この作品は、米国農務省の助成1999-35212-8680、2005から01378まで、および2010-04288-01、USDAフォーミュラファンドとグルジアの獣医学農業研究助成の状態によってサポートされています。ジョージア大学で米博4900L、GENE 4960H、BCMB 4960L、およびBIOL 4960HとMaurer氏にいくつかの分子疫学の研究プロジェクトに学生が使用する：この文書に記載されているプロトコルは、指示の研究コースの一環として、学部生が使用するために開発された実験室。我々は、研究と学部教育を統合するための努力を支援するためのマウラーとリー研究室における研究、そして私たちの学科長、ジョングリッソンを実行している多くの学部学生に感謝したい。

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

属（例：invA）に固有のサルモネラの標的遺伝子を検出するための最も市販のPCRテスト。ただし、すべてのサルモネラは動物の個体数の人間や有病率で病気を引き起こす能力に等しいです。 サルモネラ LPS O -抗原とflagellinH1とH2抗原の抗原性の違いの早期発見は、これらの抗原性の違いに基づいて、2,500以上の血清型にサルモネラの分化にリードしている。 サルモネラ属に同定された46の異なるO抗原と86の異なるフラジェリン（H）抗原があります。 サルモネラ一 （H1）または2つの異なる（H1＆H2）flagellinsを持っている可能性があります。今日認識さ2500 サルモネラの血清型の異なるOの組み合わせ、H1、およびH2抗原のアカウント。血清型は、個々のOとH抗原の同定から得られた抗原式に基づいて割り当てられます。式はOのように書かれている抗原：H1：H2、および&quot; - &quot;、O -抗原に対して陰性サルモネラ用H1またはH2フラジェリンと&quot;NT&quot;（非入力可能）の不在を指します。例えば、血清型ネズミチフス菌はS.に割り当てられます。 G、M：：-. Enteritidisが、数式D1と分離するために与えている間に1,2：I：entericaは抗原式Bで分離するサルモネラ集団におけるこの抗原変異は、したがって、容易にPCRによって悪用される可能性ヌクレオチドレベルでの相違点の外側に現れています。 我々は識別S.ためアレロタイプ化PCRを開発するために特定のOとHの対立遺伝子に関連付けられている遺伝的差異を同定したenterica血清型：サルモネラ、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌（3）。ハイデルベルク（B、ハダル（E、N、X C2：：Z10）、 - （D1：：G、M）サルモネラのためにH2抗原式：H1： サルモネラ血清型の正しい割り当ておよびレポートは、Oに関連付けられているすべての対立遺伝子のためにテストする必要があります：R：1,2）、及びネズミチフス菌（B：I：1,2）。 Oの対立遺伝子または抗原、H1 gの発見に関する知識がなくても、単独でm個の対立遺伝子は、必ずしもサルモネラは他のサルモネラの血清型としてEnteritidisのように分離識別するものではありません：Agona、カリフォルニア州、そしてモンテビデオ、またこの同じ対立遺伝子を持っている。アレロタイプ化PCRは、もともとサルモネラの血清型を説明した前面を検出するために設計されていますが、このテストではさらに19血清型（表3）を識別することができます。私たちのアレロタイプ化PCRは、もともとOとHの対立遺伝子を検出するように設計された。私たちはO -特異的抗血清を使用して、ではなく、isolated サルモネラの培養で作業するときOアレロタイプ化PCRを行うこと、スライド凝集試験によってO -抗原を識別するための練習では、それはより実用的かつ効果的なコストとなっています。しかし、我々は、ラボの画面（2）として、またはサルモネラが FTAカード（6）に提出された分離株と入力し、このPCRを使用している場合はOアレロタイプ化PCRを使用することをお勧めします、そしてサンプルの最初の画面でサルモネラ特異的PCR（4が含まれていますか）。 PCRまたは抗原/生化学検査でサルモネラと識別されたサンプルだけにアレロタイプ化PCRを制限する。 この資料に記載されているプロトコルは、アイダホテクノロジーRapidcycler、1つは反応容量を縮小することを可能にし、多くの加熱ブロックサーモよりも短い時間での反応条件を実行して熱風クラーで使用するために最適化されています。プライマー濃度を調整する;またはMgCl 2の濃度を調整し、加熱ブロックサイクラーで使用するためにこのプロトコルを適応するには、アニーリング温度を下げる/上げることによって経験的に反応条件の最適化が必要になる場合があります。例えば、我々は、PTC - 200サーマルサイクラーは以下のようにMJリサーチのためのプロトコルを適応しなければならなかった。表1で説明したのと同じ反応ボリュームでの作業、作業用ストックconcentrationof私のプライマーセットを2.5μMに希釈し、アニーリング温度は、アニーリングと伸長反応ステップ、変性は55℃から45℃、およびインキュベーション時間を低下させたI / G、Mアレロタイプ化PCRのために20秒に延長されました。適切な陽性および陰性コントロールを持つことは、公開プロトコルを含むあらゆるPCRの初期のスタートアップと最適化、に不可欠です。 、ハダル（C2：Z10：E、N、X）、ハイデルベルク（B：R - 、サルモネラ（D1：：G、M）我々は特にAnatum（：：E、H 1,6 E1）、知られているサルモネラの血清型を取得することをお勧め：1,2）、モンテビデオ（C1：G、M、S：1,2,7）とネズミチフス菌（B：I：1,2）、および実験室大腸菌 K12株（DH5α、LE393、JM109など）はそれぞれこの資料に記載されているアレロタイプ化PCR検査の陽性コントロールと陰性コントロールとして。これらのサルモネラの血清型のいくつかはテストされている対立遺伝子に応じて、正または負のコントロールとして機能します。 特定の予防措置とガイドラインは、これと他の診断PCRを行いながら、続いする必要があります。最初に、物理的な分離テンプレートの準備から、PCRは、セットアップ、およびゲル電気泳動では、汚染と偽陽性の誤った報告可能なPCRのキャリーオーバーを防止するのに重要です。これらのコントロールは、彼らが発生したときに問題を特定し、その結果（5）の解釈を助けるように加えて、適切なコントロールを含めることは、あらゆるルーチンPCRに必要です。最も重要なことは、一貫性は、特にアンプリコンの大きさのアンプリコン（PCR産物）の検出andestimationのための電気泳動条件に関しては、必要不可欠です。この点を説明するために、我々は故意に、図1Aに意図したよりも早く電気を一時停止。分子量標準（レーン1及び13）及び陽性対照（レーン2）が十分に正確なサイズを見積もるやサイズのわずかな違い（〜50塩基）が存在するDNA断片の分離を観察するために分離されていません。 DNA断片の十分な分離、特に分子量の基準は、陽性を報告すると、アンプリコンの大きさと時々あらゆるPCRの毎日ランニング（5で観察される非特異的アンプリコンから区別する&quot;真の陽性&quot;の正確な推定に依存するように不可欠である）。例えば、図1B、レーン7（サイズは〜700塩基対）の非特異的アンプリコンがあります。色素フロントがアガロースゲル中の半分の方法ポイントでのみだったとき、あまりにも早く電気泳動を中止していた、500 bpと700bpのDNA断片の間にはほとんど区別があるでしょう。従って、レーン7のサンプルが誤って両方のiとg、m個の対立遺伝子陽性と報告されているでしょう。 最後に、1つは、任意のテストに関連付けられている限界を認識する必要があります。 1,5; 1,6、1,7抗原複合体、E、N、X / E H1/H2アレロタイプ化PCRのいくつかは、H2 1,2に属する遺伝子の微妙な遺伝子の違いを識別するために差別的な力を持っていない、N、G、m個の対立遺伝子を含むZ15抗原複合体とH1 Gの抗原複合体、。つまたは2つのアミノ酸の変化は、これらの鞭毛抗原に存在する異なるエピトープを占めている。私たちはフラジェリン遺伝子配列（3）でこれらの時々、単一の塩基対の違いを悪用する可能性プライマーを設計することは困難であった。例えば、 サルモネラ血清型ダブリン（D1：G、P： - ）とベルタは（D1：F、G、T： - ）プライマーをmallelotyping、私たちのgでもPCR陽性である。 H2のアレロタイプ化プライマーは、ネズミチフス菌を区別することはできない（B：I：1,2）ラゴスから（B：I：1,5）、ハイデルベルク（B：1,2：R）ブラッドフォード（：R：B 1,5）から、グロストラップから（C2：Z10：E、N、Z15）ウィネバ（B：R：1,6）、またはサンレモ（B：R：1,7）、またはハダル（E、N、X C2：：Z10）。これらの血清型のいくつかが発生する可能性が：ラゴス、ブラッドフォード、ウィネバ、サンレモまたはGlustrupがリモートである、それは可能であり、どちらかのテスト&quot;の制限または別の確認検査に免責事項を提供する必要があります。 結論として、このPCRベースの血清型別では、急速にS.を識別します。 enterica血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルクとネズミチフス菌、及びO、H1、およびH2の対立遺伝子は、19追加の血清型に関連付けられている。このアッセイは、血清型のサルモネラに従来の微生物学的ア ​​プローチへの迅速、費用対効果の高い選択肢です。

<table border="1"><tbody><tr><th>材料名</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ルリアベルターニ</td><td></td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td> 1.5 mlの容量</td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>エタノール</td><td> 200プルーフ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td>分子生物学グレード</td><td>シグマ</td><td></td><td> （または任意の同等の源、PCRのみ） </td></tr><tr><td> 10 × PCRバッファー： </td><td> 20mMのMgCl 2の </td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> （バッファがBSA、フィコールおよびタートラジンに付属） </td></tr><tr><td></td><td> 30mMのMgCl 2の </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40mMのMgCl 2の </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCRプライマー</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td></td><td>ロッシュ</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td> Taq DNA ポリメラーゼ </td><td></td><td>デンヴィル</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>キャピラリーピペット</td><td> 10μlの体積</td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>急速なサイクラー</td><td></td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>低いEEO、分子生物学グレード</td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td> 50 X TAEバッファーまたは5X TBEバッファー</td><td></td><td>フィッシャー</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>水平、ゲル型と潜水ゲル電気泳動槽</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>電源</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr><tr><td>分子イメージャーゲルドックシステム</td><td></td><td> BioRad社</td><td></td><td> （または任意の同等のソース） </td></tr></tbody></table> 表4。材料

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

この属に特有のサルモネラの標的遺伝子を同定するための現在の商業的なPCRのテスト。しかし、そこに二つの種六亜種、2,500以上の異なるサルモネラの血清型があり、すべてではないが、公衆衛生への重要性に等しい。例えば、S.を見つけるテーブルの卵の層のファーム上にenterica亜種 IIIaのアリゾナ州は、S.の分離に比べて重要ではありませんenterica亜種I血清型Enteritidisは、テーブルの卵の消費量にリンクされているサルモネラ症の主要原因。血清型は、抗原リポ多糖の違い（LPS）（O抗原）とフラジェリン（H1とH2抗原）に基づいて識別されます。これらの抗原性の違いは、この表現型に関連付けられている遺伝子と遺伝子の対立遺伝子の多様性の外観です。 我々は、4つの主要S.間の遺伝的差異のキーというアレロタイプ化、マルチプレックスPCRを開発しているenterica亜種私血清型は家禽で発見し、米国における重要なヒトの疾患に関連付けられている。 PCRのプライマーペアは、特定のサルモネラの血清型に固有の鍵となる遺伝子またはシーケンスを対象に、その遺伝子または対立遺伝子の特定のサイズのアンプリコンを生成するように設計。 サルモネラ血清型は、特定のLPSのためのPCR検査の結果の組み合わせに基づいて分離するために割り当てられていたとフラジェリン遺伝子の対立遺伝子。この資料に記載されている多重PCRはS.の検出のための固有のものですenterica亜種I血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌。 ここでは、分離サルモネラについては血清型を識別するマルチプレックスPCRを使用する方法を示します。

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

我々はサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、およびネズミチフス菌の迅速検出のためのマルチプレックスPCRを説明します。特定のサルモネラの血清型は、特定の血清型のO -抗原の生合成クラスターとフラジェリンに固有の遺伝子との配列とPCRマルチプレックスを標的とすることで識別できます。血清型は、ターゲットの対立遺伝子に対応する固有の、大きさのアンプリコン（PCR産物）の外観に基づいて、分離株のサルモネラにして割り当てられています。

識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K ビュー.  University of Georgia. 我々はサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、およびネズミチフス菌の迅速検出のためのマルチプレックスPCRを説明します。特定のサルモネラの血清型は、特定の血清型のO -抗原の生合成クラスターとフラジェリンに固有の遺伝子との配列とPCRマルチプレックスを標的とすることで識別できます。血清型は、ターゲットの対立遺伝子に対...

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

免疫・感染学

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

腫瘍標的の測定成長と遺伝子発現ダイナミクス<em&gt; S.ネズミチフス菌</em&gt;バクテリア

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...