私たちは、リンパ性悪性ユニット、エリサ10ハッケン、リディアScarfò、マッシモアレッシオ、アントニオ·コンティ、アンジェラテガミバチ、そしてアンジェラカッタネーオに感謝します。 Associazione ItalianaのあたりのラRicercaスルCancro AIRC（ - ミルフィーユの＃9965あたり5調査官助成や特別プログラム分子臨床腫瘍）：このプロジェクトは、によってサポートされていました CSとBAは、研究を設計し実験を行ってデータを分析し、原稿を書いている。 MTSB、原稿を書くことを支援UR、FBPR。 PGおよびFCCは研究は、患者のサンプルや臨床データを提供して設計しました。

注：すべての組織サンプルはサンラッファエッレ病院（ミラノ、イタリア）の治験審査委員会の承認が得られた。 1ヒト組織サンプルおよび細胞精製（図1） 注：白血病リンパ球はマリガンらによると、CLL患者の末梢血（PB）から入手したと診断された9。 PBから1.1）白血病細胞分離<ol><li>ヘパリンナトリウムとバキュテナー採血管でPBを収集します。 </li><li> 15mlチューブに血液を移し、全血の50μL/ mLでヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し、室温で20分間インキュベートする。 </li><li> 、PBS + 2％FBSを等容量の試料を希釈してくださいインターフェイスを壊さないこと、フィコールの上に優しく、慎重にオーバーレイ血を混ぜる。希釈した試料15ミリリットルtの（ すなわち 4ミリリットルをFicoll + 10ミリリットルの血液を2部にフィコールの少なくとも1部を使用してくださいUBE）。 </li><li>ブレーキなしで20分間、室温（20℃）で400×gで遠心する。単核細胞を界面になります。 </li><li>慎重に細胞を回収し、新しいチューブにするインターフェイスを吸引。 5分間、暗所で、300×gでPBSおよび遠心分離機で一回、4℃で細胞を洗浄する。ペレットを一番下になります。 </li><li>上清を捨てる。指で前後にチューブをフリックで、残りの上清中にペレットを再懸濁。 （10％ウシ胎児血清および15 mg / mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640）を10mlの完全RPMI培地でペレットを希釈し、トリパンブルー排除法を用いて細胞数を計測する。 </li></ol> 1.2）純度評価注：すべての調製物の純度は常に99％以上であることが必要である。 <ol><li> CD3 FITC（5μL/ TES：;以下の抗体（材料の表を参照の市販品）で精製された細胞懸濁液100μlをインキュベートt）は、CD14 PE（5μL/テスト）、CD19 ECD（6μL/テスト）、CD16-CD56 PC5（2μL/テスト）、CD5 PC7において、4℃で20分間（4μL/テスト）、 FACSチューブ。 </li><li> （300×gで5分間遠心）4mlのPBSでサンプルを洗浄し、プロットにようにその表面にCD19およびCD5を共発現するCLL細胞（&gt; 99％）の％を流れcytometry.Checkによる純度を確認する図1に示されている（6）。準備がゼロに近いあるべきプロットで、CD3、CD14およびCD16-56の％をチェックすることにより、NK、Tリンパ球および単球の事実上欠いていることを確認してください。 </li></ol> 1.3）サンプルストレージ<ol><li>プロテオミクス研究のために、1.5mlチューブ中で25×10 6個の細胞、10分間300×gで遠心分離細胞は、4時間上清と凍結乾燥ペレットを捨てる集める。 -80℃で使用するまで保管してください。 </li><li>検証アッセイ、完全RPMI中に再懸濁細胞（の場合は量である、さらに、アッセイに依存選択された）、ステップ4に進みます。 </li></ol> 2。二次元電気泳動（2-DE）（図2） 2.1）等電点電気泳動（IEF） <ol><li> 380μlの2-DEバッファー（RBthio液の344μlの（9 M尿素、10 mMトリス、4％CHAPS）、65ミリメートル、DTT、2％IPGバッファーアンフォラインの6μlと30μlの最終容量でCLL細胞ペレットを可溶化pHは4-7）。 </li><li> 18 IPGストリップ（pHは4-7）に、タンパク質サンプル（1 mg）を適用し、コンティらによって説明されている標準的なプロトコルに従って、IEFを実行します。10 </li><li> RTで15分間、新鮮なDTTを2％を補充した、（6 M尿素、30％グリセロール、2％SDSを含有する50mM pH8.8のトリス-HCl緩衝液EB）平衡化バッファー2mlにストリップを平衡化する。破棄EB + DTTおよびEBの2ミリリットルを追加し、2.5％ヨードアセトアミドを補充した。ロッキングプラットフォーム上で室温で15分間インキュベートする。 </li></ol> 2.2）のSDS-PAGE <ol><li>削除したゲルに触れることなく、紙の上のストリップを乾燥さEBの過剰。 9から16%勾配​​SDS-PAGEゲルの上に各ストリップをロードします。ストリップの装着を容易にするために、ゲルの上に（w / vのトリス、25mMのグリシン192 mMの、SDS 0.1％）をSDS-電気泳動バッファーを少量を追加します。 </li><li>電気泳動ユニットを組み立て、SDS-電気泳動緩衝液で埋めるその後、ストリップの浮き上がりを防止するために、寒天溶液（0.8％）の〜5ミリリットルを添加することによりゲルをシールする。 4℃で4時間、60ミリアンペア/ゲルで実行を行います。 </li><li>電気泳動装置からゲルを外し、適切な染色ボックスに入れてください。 </li></ol>調製用ゲル2.3）銀染色<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> 50％メタノール、12％酢酸 0,05％ホルマリン</td><td> 2時間（または一晩）* </td></tr><tr><td>洗浄バッファー</td><td> 35％Ehanol </td><td> 20分（ステップを3回繰り返す） </td></tr><tr><td>増感</td><td> 0,02％チオ硫酸ナトリウム</td><td> 2分</td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5分（ステップを3回繰り返す） </td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td> 0.2％硝酸銀0076パーセントホルマリン</td><td> 20分</td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1分（2回ステップを繰り返す） </td></tr><tr><td> DEVELOPER </td><td> 6％炭酸ナトリウム0.0004％チオ硫酸ナトリウム 0,05％ホルマリン</td><td>染色は、十分になるまで</td></tr><tr><td> STOP </td><td> 50％メタノール</td><td> 30分</td></tr><tr><td></td><td> * 2時間は、タンパク質固定化に必要な最小時間である</td><td></td></tr></tbody></table> 表1。 NOTE：タンパク質スポットはMS互換銀染色11でゲルを染色することによって可視化することができる。必要なすべてのソリューション銀染色のために、表1に記載されています。 <ol><li>各溶液/ゲルの約200mlを準備し、 表1に示したように進んでください。慎重にゲルを含む染色ボックスに各ソリューションを追加します。ロッキングプラットフォーム上のすべてのインキュベーションを行います。 </li><li>染色後、停止液を除去し、買収されるまで1％酢酸の溶液中でゲルを残す。 </li></ol> 2.4）ゲルの取得と解析<ol><li>染色から3日以内に、濃度計を用いて、高解像度で画像を取得します。 </li><li> 2-DEゲルのソフトウェアを使用して2-Dのタンパク質パターンを分析する。 メモ：ソフ​​トウェアが高速かつ信頼性の高い画像比較が可能になります。 <ol><li>コンテキストメニューから「新規プロジェクトを作成」を選択して、プロジェクトを作成します。フォルダを作成し、tifファイルで「輸入ゲル画像」を選択することで、ゲルをインポートし、.PNG。または.gel拡張子。 </li><li>ゲルはworkspにインポートされ、追加されるとエースは、スポット検出用のゲルを選択し、メニューの「編集&gt;スポット&gt;検出する」を選択することで自動化されたスポット検出を行う。 </li><li>次に、メニューの「減算バックグラウンド」から選択することで、背景差分を行う。注：複数のゲルを比較し、定量的および/または定性的分析による差異または類似性を検出することが可能であることを後</li></ol></li></ol> MALDI-TOF MS分析により3タンパク質同定（図3） 3.1）タンパク質消化<ol><li> （清潔なメスで切断する）マニュアルによって、あるいは自動化された切除のいずれかによってゲルからの関心の水と物品税のスポットを有するゲルを洗い流す。 </li><li>水で洗ってゲル粒子（100-150μL）、（400×gで30秒）をスピンダウンし、液体を除去する。 </li><li>ゲル片に、CH 3 CNの（ゲル体積に応じて）、等量を追加し、ゲル片が縮小するまで、10〜15分間待ちます。ゲル粒子を乾燥させるiのナの真空遠心。 </li><li> 50 mMのNH 4 HCO 3で希釈した10 mMのジチオエリスリトールの75〜100μLを加え、56℃（還元工程）で30分間インキュベートする。ステップ3.1.3で説明したように、再びCH 3 CNとゲル片を縮小。 </li><li> 55mMのヨードアセトアミドを50mM NH 4 HCO 3中で希釈し、暗所で室温で20分間インキュベートし、溶液の75-100を添加することによりアルキル化を進める。 </li><li>ステップ3.1.3で説明したようにゲル断片をカバーするのに十分な量を使用して、CH 3 CNでもう一度ゲル片を縮小。真空遠心分離機中で乾燥。 </li><li> 25mMのNH 4 HCO 3を含有する緩衝液中の粒子、5mMのCaCl 2を、4℃にてトリプシンの12,5 ngの/μlを20分間再水和する。ゲル片をカバーするためにバッファーの十分な量を使用してください。ゲル片から吸収されない上清を除去し、25 mMのNH 4 HCO 3、5 mMのCaCl 2をトリプシンなしでCOVを追加ERゲル。 </li><li>一晩37℃で少なくとも3時間（ペプチド消化に必要な最小時間）でサンプルにしておきます。 </li></ol> 3.2）質量分析（乾燥液滴法） <ol><li>ステンレス鋼のMALDIプレート上の各サンプルスポット1μlのアリコートおよび50％のCH 3 CNおよび0.1％TFAで調製し、マトリックスとしてα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸、1μlを混ぜる。 </li><li> MALDI-TOF質量分析計で質量スペクトルを取得する。信号の飽和を防止するか、シグナルを増大させるために、レーザ強度​​を調整する、スポット当たり約200スペクトルを蓄積する。データエクスプローラのソフトウェアを介してプロセスのスペクトルは、下記のように： <ol><li> .datファイルをインポートし、「プロセス&gt;ベースライン補正」を選択することで、ベースライン補正を行う。 &quot;プロセス&gt;質量キャリブレーション&gt;手動校正を選択することで、トリプシン自己分解生成物およびマトリックスピークを用いて質量を校正します。のm / z 855.1および2163.1 Bに近いピークを選択するyを左ドラッグし、「プロット」をクリックして、手動校正ウィンドウに「キャリブレーションを適用する」、その後、対応する基準質量を選択します。 </li><li> 、ピーク検出（「ピーク&gt;ピーク検出」）のためのしきい値を調整するアクティブ·トレースを複製（「表示&gt;アクティブなトレースを複製」）、新しいトレースを選択して、deisotoping（「ピーク&gt; deisotoping」）を実行します。マクロ「getpeaklist」を使用して、識別のために使用される質量のリストを生成する。必要に応じて、手動でノイズ信号を除去するピークリストをきれいにし、より良い識別を取得するように選んだ。 </li></ol></li><li>検索エンジン12として深いとマスコットを使用した総合的な非冗長タンパク質データベースを検索することにより、タンパク質を同定する。 <ol><li>すべての検索で、次のパラメータを使用します。1は、固定の修正とのinitiなどのペプチドあたりの切断、変数の変更などのメチオニンの酸化、システインカルバミドメチル化を逃した50ppmのAlの質量公差。 </li></ol></li></ol> 4。細胞骨格活性アッセイ（図4） 注：再懸濁細胞を、完全RPMI（10 6細胞/200μl）をステップ1で精製した。 4.1）遊走アッセイ。このテストでは、分析した細胞（リンパ球）の移動能力の定量化を可能にする。 6.5ミリメートル径と5.0μmの孔サイズのトランスウェルチャンバーを使用し、三連でアッセイを行う。異なる細胞型の場合には細孔サイズおよび移動時間（ステップ4.1.3）を最適化する。 <ol><li>それぞれ誘起さを測定し、自発的な移行のために特定の刺激（ すなわち 、SDF-1）の有無にかかわらず完全RPMI600μlのを追加して下室を準備します。 </li><li>その上に上部チャンバーを入れて、システムがインキュベーター内で37℃で30分間平衡しましょう​​。 </li><li>シード10 6細胞/上部チャンバー内に200μl（総細胞数）とインキュベートインキュベーター内で37℃で4時間プレート。 </li><li> 、上部チャンバーを取り外し下部チャンバー内のメディアを収集し、1mlのPBSで一回下室を洗う。チューブにPBSを収集します。 </li><li> 5分300×gで遠心分離し、500μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。 </li><li>フローサイトメトリーによって、取得の1分後に遊走した細胞の数を数える。単離された細胞集団の場合には、任意の表面抗体を添加する必要はない。細胞の側が散乱し、計算に使用する番号である1分、で可視化されるイベントの数を考慮し、二次元ドットプロット中の細胞数を確認してください。 </li><li>として移行インデックス（MI）を計算します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" /></li></ol> 4.2）接着アッセイ。このアッセイは、細胞の接着能を測定することを可能にする。三連でアッセイを実行します。 <ol><li>プレコート96-WELlsコマンドの50μlを有するプレート（平底）/ウェルのいずれか一晩4℃で、PBSで希釈し、2％BSA-PBS（背景として）または1μgICAM-1。 </li><li> PBSで2回プレートを洗浄し、37℃で1時間、2％BSA-PBS（100μl/ウェル）を添加することによって非特異的部位をブロックする。 </li><li>完全RPMI中5×10 6 / mlでその間の再懸濁細胞では、1 mMのCMFDA緑色の細胞トラッカーでそれらにラベルを付け、37℃で30分間インキュベートする。 </li><li>ブロッキング溶液（ステップ4.2.2）を廃棄した後、1×10 6細胞/ウェルで予めコーティングしたウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> ELISAリーダー（：485 nm、発光フィルター：535 nMの励起フィルター）を使用して接着性を定量化する。総入力（INPUT）の最初の測定を行います。 </li><li> 2％BSA-PBSで穏やかにプレートを洗浄し（200μl/ウェル）4回（x）である。各洗浄工程（接着x）の後に、プレートの読み取りを行います。 </li><li>各測定のためのバックグラウンドを差し引いた後に、特定のadhesを計算イオン（接着）： <img alt="式（1）" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" /></li></ol> 4.3）重合アッセイ。これは、F-アクチンの重合を定量比色アッセイである。三連でアッセイを実行します。 <ol><li>再懸 ​​濁1×10 ^予め温め完全RPMI100μl中6個の細胞、10分間、特定の刺激（ すなわち 、α-IgM抗体を20μg/ ml）を追加します。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド400μlので反応を停止し、室温で10分間、細胞を固定。 </li><li> （5分、4℃、300×gで遠心分離）をPBSで3回洗浄する。 </li><li>上清を破棄し、2分間氷上でPBS-サポニン0.2％（200μl）を用いて細胞を透過性。 </li><li> PBS-サポニン0.1％（5分間100×gで遠心、4℃）で3回洗浄し、100μlのPBS-サポニン0.1％上清と再懸濁を捨てる。 </li><li>室温tでの30分間のファロイジン-アレクサ488（3μg/ ml）を用いて染色暗闇の中でemperature。 </li><li> PBS-0.1％サポニンで3回洗浄する。 300μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。 </li><li>ファロイジンの平均蛍光強度（MFI）を計算する、フローサイトメトリーによってF-アクチンの量を定量する。蛍光強度に基づいてヒストグラムを生成するために、一次元プロットで生成されたデータを分析し、MFI値はグラフレポートに示されている。 </li><li> F-アクチンの重合（ΔF-アクチン）などを測定します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+are+we+getting+closer+to+understanding+the+pathogenesis+of+the+disease.">Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease.</a> J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).</li><li>Rawstron, A. 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The authors have nothing to disclose.

<html>本稿の目的は、このアプローチは他の疾患および/ ​​または他のサンプルタイプ16-18に拡張することができる場合であっても、CLLの病因に関与する分子の同定のための最適化されたプロトコルを記述することである。悪い予後19 対 ​​良好CLL患者の2サブセットのプロテオミクスプロファイルを比較することによって、私たちは、彼らがHS1のリン酸化状態が異なり...

慢性リンパ性白血病（CLL）、西洋諸国の中で最も一般的な成人の白血病は、モノクローナル腫瘍性CD5 + Bリンパ球の蓄積から派生し、臨床的に非常に不均一である。それは、モノクローナルB細胞リンパ球増加症（MBL）1,2,3として定義前白血病の形として存在することができる。病気はどちら無痛臨床経過と表示されることが他のケースでは、それは、治療を必要とする前に、何年も安定した状態を保つことができ、あるいは予後不良を伴う進行化学療法抵抗性疾患などの治療にもかかわらず。最後に、頻繁に致命的な高悪性度リンパ腫（リヒター症候群-RS）2,3,4に進むことができる。疾患の転帰および生存の予測因子に関する補足情報を提供して予後因子のセットに基づいて、良い面と悪い予後：患者は通常、2つの主要なサブセットに分類される。臨床異質性が可能性が高い生物学的な不均一性を反映している。遺伝、微小環境およびCEの数全く統一メカニズムは5見出されていないにもかかわらずllular因子は、疾患の病因に同意することが示されている。詳細には、いくつかの研究は、疾患の臨床経過の差が部分的に予後値6,7,8を持ついくつかの生物学的マーカーの存在（または不在）によって説明することができることを実証した。これらのデータは、疾患の生物学のより良い理解の両方の予後マーカーおよび治療標的の同定により、病状の臨床管理のための追加のヒントを提供することができることを実証した。 本研究の目的は、異なるプロテオーム技術の組み合わせは、CLLの発症および進行に関与するタンパク質の同定のために使用することができる方法を示すことである。われわれのアプローチは、共に基本的なプロテオミクスおよび臨床データ5を結合することが可能であることを示している。 選択された患者から現在のワークフローでは、一次白血病細胞（予後不良対良好な）単離され、そして細胞溶解物をプロテオームマップを得るために使用される。 2DEは、このように、各タンパク質の生物学的活性に間接的に情報を与えて、翻訳後修飾を含む細胞集団のプロテオミクスプロファイルの特徴付けを可能にする。全細胞溶解物は、それらの分子量に基づいてタンパク質を解決するポリアクリルアミドゲル上で泳動二次元続いて、等電点に基づく第一次元の実行によって解決される。プロテオームマップの比較分析は、示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする（両方の存在量および翻訳後修飾の点で）を切断し、質量分析によって分析することができるゲル上のスポットとして。各候補の役割は、異なるアッセイによって悪用される可能性があります。 現在の原稿にCLLに限定このアプローチは、簡単に、したがってproteomiについての情報を提供する、他の疾患/サンプルに拡張することができ両群間のC /生物学的な違いは、（通常の対すなわち病的な、ノックダウン対非刺激、野生型対刺激さ）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Acetonitril</td>
			<td style="width:160px;">MERCK</td>
			<td style="width:111px;">61830025001730&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">A6141-500G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">D9680-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">I6125-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">223506-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:160px;">ROCHE</td>
			<td style="width:111px;">11418475001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">T6580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">ZipTip&#181;-C18</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>ZTC18M096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>15064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBS</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">FBS</td>
			<td>DOMINIQUE DUTSCHER</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Lymphoprep</td>
			<td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypan Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD19</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07770</td>
			<td>ECD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD5</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07754</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD3</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07746</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>345785</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD16</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07767</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD56</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07789</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:160px;">GE-Healthcare</td>
			<td>11-0033-64&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Urea</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Hcl Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CHAPS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DTT</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9163-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGstrips</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-1233-01&#160;</td>
			<td>Linear pH 4-7 18cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGbuffer</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-6000-86</td>
			<td>pH 4-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-3188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDS</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrilamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarosio</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Methanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formalin</td>
			<td>BIO-OPTICAL</td>
			<td>05-K01009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>72049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silver Nitrate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>85228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageMaster 2D Platinum 5.0</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A0250292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MALDI-TOF Voyager-DE STR</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Data Explorer software (version 3.2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">transwell chambre 6.6 mm diameter</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RPMI</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB2000L</td>
			<td>WITH L-GLUTAMINE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Gentamicin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDF-1</td>
			<td>PREPROTECH</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BSA</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CMFDA</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>C7025</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IgM</td>
			<td>SOUTHERNBIOTECH</td>
			<td>2020-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Saponine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S-7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa fluor 488</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a 2de-gel spot to protein function: lesson learned from hs1 in chronic lymphocytic leukemia

腫瘍の開始と進行に関与する分子の同定は、患者の臨床管理のために、結果として、理解病の生物学のための基本であり。本研究では、慢性リンパ性白血病（CLL）の進行に関与する分子の同定のために最適化されたプロテオミクスアプローチを説明する。詳細には、白血病細胞溶解物を、2次元電気泳動（2DE）によって解決され、2DEゲル上の「スポット」として可視化した。プロテオームマップの比較分析は、採取、単離および質量分析（MS）により同定される（存在量および翻訳後修飾の点で）示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする。同定された候補の生物学的機能は、私たちが一次白血病細胞のために最適化されていること、異なるアッセイ（ すなわち遊走、接着およびF-アクチン重合）によって試験することができる。

私たちは、一次白血病B細胞はCLL患者のPBを形成する単離され、私たちはプロテオームマップを分析した。サンプルた（n = 104）は、各患者の臨床的特徴に基づいて、2つの主要なサブセット（良好な予後対悪い予後）にグループ分けし、2DEゲルの比較分析を行った。 分析許容差次つのサブセット間で発現スポットの同定（翻訳後修飾の変化を暗示存在/不在又はゲル?...

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From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K ビュー.  IRCCS, San Raffaele Scientific Institute. ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。 

ビデオ: From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

人間の舌から茸（味）乳頭を収集する手法

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

医学

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

慢性非流暢失語症脳卒中患者における言語機能を改善するために反復経頭蓋磁気刺激の活用

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

集団研究への参加を最大化するために健康バイオマーカーの血液スポットコレクション乾燥させ

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

マウスの膀胱痛に対するモデルとしての膀胱膨満誘発内臓運動応答

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

慢性腎臓病患者における血管機能の評価

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

慢性血栓塞栓性肺高血圧症とピグレットにおける右室機能の評価

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical activity and longer life expectancy. Despite its increasing prevalence, the underlying pathogenesis still remains unclear, and treatment is generally symptomatic. Recently, numerous therapeutic options, including growth factors, stem cells, and gene therapy, were investigated in hopes of enhancing the healing potency of the degenerative tendon. However, the majority of these research studies were conducted only on animal models or healthy human tenocytes. Despite some studies using pathological tenocytes, to the best of our knowledge there is currently no protocol describing how to obtain human degenerative tenocytes. The aim of this study is to describe a standard protocol for acquiring human degenerative tenocytes. Initially, the tendon tissue was harvested from a patient with lateral epicondylitis during surgery. Then biopsy samples were taken from the extensor carpi radialis brevis tendon corresponding to structural changes observed at the time of surgery. All of the harvested tendons appeared to be dull, gray, friable, and edematous, which made them visually distinct from the healthy ones. Tenocytes were cultured and used for experiments. Meanwhile, half of the harvested tissues were analyzed histologically, and it was shown that they shared the same key features of tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia or hyperplasia). A secondary analysis by immunocytochemistry confirmed that the cultured cells were tenocytes with the majority of the cells having positive stains for mohawk and tenomodulin proteins. The qualities of the degenerative nature of tenocytes were then determined by comparing the cells with the healthy control using a proliferation assay or qRT-PCR. The degenerative tenocyte displayed a higher proliferation rate and similar gene expression patterns of tendinopathy that matched previous reports. Overall, this new protocol might provide a useful tool for future studies of tendinopathy.

In vitro use of degenerative tenocytes is essential when investigating the efficacy of novel treatment on tendinopathy. However, most research studies use only the animal model or a healthy tenocyte. We propose the following protocol to isolate human degenerative tenocytes during surgery.

人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...