この方法は、患者の正確な予後など、慢性リンパ性白血病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで高速で、非常に正確であることです。この技術の意味は、正確な予後が後に疾患の治療管理を定義する可能性があるため、強い予後、特に慢性リンパ性白血病患者に対するリスク認証にまで及ぶ。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、PCR製品の選択や消化順序解析タイプなど、精度と経験の両方を必要とするため、学習が困難であるなど、非常に重要です。この手順を開始するには、EDTAの200マイクロリットルを50ミリリットルの無菌コレクションチューブに加えます。チューブに末梢血20ミリリットルとRPMI培地15ミリリットルを加え、ピペットを2~3回上下に加えます。
次に、15ミリリットルの密度勾配培地を新しい50ミリリットルのコレクションチューブに加えます。末梢血溶液を密度勾配培地にゆっくりと重ね、勾配を乱さないようにします。遠心分離機ブレーキをオフにして20分間Gの800倍で遠心分離機。
次に、滅菌パスツールピペットを使用して、上部プラズマ血小板層と密度勾配媒体層の間に形成された単核細胞リングを収集し、それを新しい滅菌15ミリリットルの採取チューブに移します。最終容積が12ミリリットルになるようにRPMI培地を加え、溶液を上下にピペットして混ぜます。8分間Gの800倍で遠心分離機。
上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのRPMI培地で再び懸濁させる。8分間Gの750倍で再び遠心分離機。この後、上清を捨て、細胞ペレットをPBSの1ミリリットルに溶解する。
新しいバウアープレートを使用して、20マイクロリットルのサンプルと80マイクロリットルの1〜10ターク溶液を混合して細胞数を形成する。サンプルの下流処理が同日に予定されていない場合は、試料を8分間Gの750倍にして遠心する。上清を捨て、セルペレットをマイナス80度で保存します。
まず、各サブグループプライマーの正モル量を使用してプライマーミックスを調製し、不偏増幅を確実にします。テキストプロトコルの表2に示すように、PCR試薬を混合します。混合PCR試薬を含むPCRチューブに、0.5マイクロリットルのTAPポリメラーゼを加えます。
次に、gDNAの100ナノグラムまたは2マイクロリットルのcDNAを加えます。テキストプロトコルの表3に詳述されているように、サーマルPCRプロトコルを実行します。その後、IGHPFR1プライマーを混合する場合は、IGHVリットルプライマーまたは350塩基対を使用する場合、約500塩基対のPCR産物がないか確認してください。
PCR製品の精製を開始するには、PCR産物の総容量を3%低融解アガロースゲルにロードします。PCR 製品がバックグラウンドから分離されるまでゲルで実行できるようにします。鋭い顕著なPCRバンドを切り出し、それらを浄化し、溶出する。
2 つの再調整が検出された場合は、両方のバンドを切り離し、個別にシーケンスする必要があります。exo-sap のクリーンアップを実行するには、使用する特定のボリュームに関する製造元の指示に従ってください。各サンプルを穏やかに渦を混ぜて、37°CのPCRブロックで30分間混合してインキュベートします。
酵素を摂氏85度に15分間加熱して不活性化します。この後、少量のPCR産物を3%のアガロースゲルにロードして、製品の純度を評価します。シーケンス処理の前の最後のチェックポイントは、フラグメント分析を使用してサンプルのクローン性を決定することです。
シーケンスの分析を開始するには、適切なソフトウェアを起動します。ホモ・サピエンスなどの種、受容体の種類または遺伝子座を指定します。fasta 形式で分析するシーケンスをペースアップし、1 回の実行で最大 50 のシーケンスをバッチでテキスト領域に識別子を含めます。
次に、結果の次の 3 つの表示オプションのいずれかを選択します。詳細ビュー:各シーケンスの結果を個別に取得するには、このオプションを選択します。合成ビュー:IGHV遺伝子と対立遺伝子名または配列入力順に並べ替えられた要約テーブルをコンパイルするには、このオプションを選択します。
このオプションは、送信されたバッチ内の配列の配列のアライメントも提供し、送信されたバッチ内で同じ IGHV 遺伝子と対立遺伝子、最後に Excel ファイルに割り当てられます。すべての出力ファイルを 1 つのファイルに組み込まれたスプレッドシートとして提供します。IGHVリットルプライマーの使用のみ、再配列されたIGHVの全長の増幅を可能にし、したがって、真のHSM負荷を決定することを可能にする。
PCR産物は約500塩基対です。IGHVリットルプライマーが凝固IG再配列を増幅できない稀な例では、IGHBFR1プライマーが使用され得る。PCR産物は約350塩基対です。
取得したシーケンスは、IMG TVクエストツールを使用して分析されます。結果表の最初の行は、シーケンスの機能を示し、IG の並べ替え順序は、生産的または非生産的のいずれかである可能性があります。IGH遺伝子の再構成は、VDJ領域内に存在するコドンが停止し、挿入/欠失のために再構成がフレームから外れている場合に非生産的である。
生産性と機能の再調整を更に分析する必要があることに注意することが重要です。デフォルトの IMG TV Quest パラメーターを使用する場合、挿入と削除は自動的に検出されませんが、シーケンスにこのような変更が含まれる可能性があることを示す厳密な兆候がツールによって提供され、結果の概要テーブルの下に警告アラートが表示されます。この手順を試みる場合、クローナル結合がポリクローナルの背景から識別できるように、PCR製品を十分に長くゲルに着陸させることが重要です。
その開発後、この技術は、慢性リンパ球性白血病免疫遺伝学の分野の研究者が患者の体細胞エピ突然変異状態の予後的影響を探求する道を開いた。臭化エチリウムで作業することは非常に危険であり、常にボンネットの下で作業するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
