この方法は、推定標的遺伝子の同定や病原性メカニズムなどの腫瘍学の分野における重要な情報を提供し、潜在的な治療介入を開発するのに役立ちます。この技術の主な利点は、NFAT2および他の転写因子と既知および新規の標的遺伝子との相互作用を検出できることである。一般的に、この方法に新しい個人は、最適な固定と剪断条件を確立することが困難であるため、苦労します。
1.5ミリリットルのチューブを1ミリリットル37%ホルムアルデヒドで満たします。その後、別の1.5ミリリットルチューブに1.25モルグリシンの1ミリリットルを5ミリリットルのチューブに4ミリリットルのPBSで充填します。次に、細胞の刺激がテキストプロトコルに従って細胞を回転させ、500マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁し、氷で満たされた箱にチューブを入れた。
細胞に37%ホルムアルデヒドの13.5マイクロリットルを加え、上下にピペットで混ぜます。その後、懸濁液を室温でインキュベートする。この後、57マイクロリットルの1.25モルグリシンを加えて固定を止める。
そして、懸濁液を室温で5分間インキュベートする。インキュベーション期間の直後に細胞を氷の上に置き、細胞を摂氏4度で5分間5分間Gの500倍に遠心します。その後、上清を吸引します。
次に、200倍Gの氷冷PBSを1ミリリットルで摂氏4度で5分間洗浄し、上清を取り除きます。細胞ペレットを5ミリリットルのリシスバッファー1つに再懸濁し、上下にピペット処理します。その後、氷の上にサンプルを置き、10分間振ってそれらをインキュベートします。
この後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心する。その後、慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。5ミリリットルのリシスバッファー2とピペットを上下に均質化して混合します。
その後、氷の上の細胞を揺れで10分間インキュベートします。インキュベーション期間の後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心し、上清を慎重に取り除きます。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤を有する剪断緩衝液中の細胞ペレットを再懸濁する。
その後、氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。気泡を形成しないように注意を払って、細胞懸濁液の140マイクロリットルを超音波管に移します。チューブを摂氏7度の焦点を合わせ、10~7分と1/2分間せん断します。
細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。試料を摂氏4度で10分間10分間15、700倍Gで遠心分離し、新しいチューブに上清を集める。まず、1つの1.5ミリリットルチューブの各沈殿物に対して20マイクロリットルのタンパク質Aコーティングビーズを調製します。
ビーズを磁気ラックに1分間落ち着かせ、上清を取り外します。次に、40マイクロリットルの1Xチップバッファーでビーズを10マイクロリットルで洗浄し、タンパク質Aコーティングビーズの20マイクロリットルごとに、上下にピペット処理します。ビーズを磁気ラックに1分間落ち着かせ、上清を取り外します。
この洗浄プロセスをさらに3回繰り返してから、ビーズを元の体積1X chIPバッファー1に再中断します。BSAプロテアーゼ阻害剤、5X chIPバッファー、およびChIP-seq等級水をビーズに加えます。次に、シアドクロマチンを加えます。
10マイクログラムの抗NFAT2抗体を使用してNFAT2を捕捉し、IgG抗体を2.5マイクログラムのコントロールとして使用します。6 RPMで回転する車輪の4°Cで一晩混合物をインキュベートする。翌日、Gの7,000倍で5秒間チューブを回転させ、磁気ラックに1分間インキュベートします。
その後、上清を吸引し、1、2、3、および4連続して洗浄バッファーでビーズを1回洗浄します。磁性ラックのチューブを1分間インキュベートする前に、7000倍Gで5秒間チューブを回転させます。その後、上清を取り出し、次の洗浄バッファーを追加します。
最後の洗浄後、磁性ラックのチューブを1分間、7000回G.Incubateで5秒間回転させます。上清を取り除き、溶出バッファー 1 の 100 マイクロリットルでビーズを取ります。その後、回転ホイールのチューブを30分間インキュベートします。
次に、チューブを短く回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、溶出バッファー2の4マイクロリットルを加えます。入力制御を作成するために、1マイクロリットルのシアドクロマチンと溶出バッファー19マイクロリットルと溶出バッファー2の4マイクロリットルを混合する。
その後、摂氏65度で4時間、サンプルを振ってインキュベートします。この後、チューブに100%イソプロパノールの100マイクロリットルを加えます。渦を回し、サンプルを7000倍のG.で5秒間回転させ、各サンプルに10マイクロリットルの磁気ビーズを加えます。
室温で回転ホイール上のサンプルを1時間インキュベートします。次に、チューブを短く回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を吸引し、100マイクロリットルの洗浄バッファー1にビーズを再懸濁する。
チューブを反転して、室温で回転ホイールで5分間混合してインキュベートします。次に、チューブを少し遠心分離します。磁気ラックに1分間置き、ピペットを使用して上清を取り除きます。
その後、100マイクロリットルの洗浄バッファーを2個加えます。チューブを反転して、室温で回転ホイールで5分間混合してインキュベートします。この後、チューブを短く遠心分離し、1分間磁気ラックに入れてください。
吸引によって洗浄緩衝液2を取り外し、溶出バッファーの55マイクロリットルにビーズを再懸濁させる。沈殿したDNAを室温で回転する車輪の中で15分間インキュベートする。この後、チューブを短く回転させ、1分間磁気ラックに入れてください。
最後に、上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。このプロトコルは、最初に、潜在的なNFAT2標的としてLCKを分析するJurkat細胞で行われた。ここに示すように、最適な結果はIL-2陽性対照およびLCK DNAの有意な濃縮によって文書化された。
最適でないせん断または欠損固定は、質の悪いDNAにつながる可能性があります。最後に、このプロトコルは、実験対象として陽性対照として機能するCD40LとLCKを有する一次ヒトCLL細胞で行われた。LCK DNAの強い濃縮によって示されるように、LCKは、初原ヒトCLL細胞における直接NFAT2標的である。
不十分な剪断は、質の悪いDNAをもたらすと、最適でない結果を返すことができます。この手順を試みる間、固定と超音波処理のステップは、この方法の成功のために重要であり、分析される細胞に調整する必要があることを覚えておくことが重要です。
