このプロジェクトは、土地バーデン=ヴュルテンベルク州が資金提供だけでなく、欧州連合（EU）による、ユーロぺッシャーフォンエリーゼオルシEntwicklungダイた。著者らは、熟練した技術支援のためのU251-MG-L106-Grx1-roGFP2細胞株とクラウディアヒンツェを提供するためのライナー·ウィッティヒ（ILMウルム）をお願いいたします。

1。細胞スフェロイドの成長とインキュベーション<ol><li>実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド<ol><li> （6プレートのために十分な）の30ml培地にアガロース物0.45gを添加することによって培養培地中で1.5％アガロースを準備する。 </li><li>随時、それを攪拌しながら、ステップ1.1.1から少なくとも80℃まで混合物を加熱する。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルにステップ1.1.2からの加熱混合液50μlを記入し、それが1〜2時間以内に固化してみましょう。使用するまで5℃で冷蔵庫に閉じられ、覆われたプレートを保管してください。 </li><li>ハム10％ウシ胎児血清（FCS）を補充したF-12培地と1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で調製し、96ウェルプレートの各ウェル中150 MCF-7乳癌細胞についてのシード。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター中で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる76; C。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター中で2μMおよび（培養液中の）8μMの範囲の濃度で6時間、アントラサイクリン系抗生物質塩酸ドキソルビシンによる細胞スフェロイドを培養する。 </li><li>前顕微鏡に培養液またはアールの平衡塩類溶液（EBSS）を有する細胞スフェロイドを洗ってください。 </li></ol></li><li>実験2：酸化還元センサーを発現しているスフェロイドにおける酸化プロセス<ol><li>永久にDMEM中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル（ス​​テップ1.1.1-1.1.3に記載された手順）でグルタチオン敏感な緑色蛍光レドックスセンサーGrx1-roGFP2でトランスフェクトした400 U251-MG-L106神経膠芽腫細胞についての種子10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150μgの/ ml）を補充した培地。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。 </li><li> 10＆＃を追加します。181は、100 mMのストック溶液を作成するために990μlの再蒸留水に過酸化水素水（purum年率、≥30％）のlは12時間以内に使用する。 </li><li>右の実験前にEBSS中、50μMのステップ1.2.3から原液を希釈する。 </li><li>レドックスセンサーの酸化のためEBSS中50μMの過酸化水素と、測定中にマイクロ流体システムを介して細胞スフェロイドを培養する。 </li></ol></li><li>実験3：開始およびスフェロイド内の細胞壊死のラベリング<ol><li>補充したDMEM培地中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル中の種子約400細胞（ 例えば、U251-MG-L106-Grx1-roGFP2の神経膠芽腫細胞）（手順のステップで説明1.1.1-1.1.3） 10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150 mg / mlで）。 </li><li> 5％のCO 2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。 </li><li>細胞をインキュベート細胞壊死を誘導する培地中の1μMの濃度で3時間、ミトコンドリア電子伝達阻害剤であるロテノンでスフェロイド。さらに、壊死細胞を標識するための1mlの培養培地中で1μlの濃度で3時間、緑傷害性色素と共インキュベートする。 </li><li>前顕微鏡に培養培地またはEBSSを用いて細胞スフェロイドを洗ってください。 </li></ol></li></ol> 2ライトシート調整注：最良の結果を達成するためには、シート光のビームウエストは、対物レンズの焦点面にあることを保証しなければならない。ビームウェストの位置は、（ - 2.8手順2.5を参​​照）、キャピラリーに対して垂直な位置にシート光を観察することによって整列させることができる。 <ol><li>文献に記載されているように、倒立顕微鏡を使用し、SPIMの励起モジュールをマウントします。 16、位置決めテーブルのベースプレートに（ 図1Aを参照）。 </li><li> 1と顕微鏡を装備0X / 0.3または20X / 0.5顕微鏡対物レンズや顕微鏡の検出経路の適切なロングパスフィルタ（ 例えば、λ≥515 nm）を。 </li><li>顕微鏡の検出ポートに統合するカメラをマウントします。 </li><li>優先的に470nmの励起波長でレーザーまたはレーザーダイオードを並列にコリメートされたビームを使用し、SPIMモジュールに適用する。 </li><li>シート光のビームウエストの軸調整のための垂直位置に光シートを転送する、90度の円柱レンズを回転させます。 </li><li>サンプルホルダー内の蛍光色素で液体を含むキャピラリーを置きます。 </li><li>顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管で試料ホルダーを取り付け、それを中心とし、シート光のビームウエストにフォーカスがあるされるように、キャピラリの位置を合わせる。 </li><li>シリンドリカルレンズ自体の軸方向の位置の変化によってビームウエストを調整します。広告の後にレンズを引き返すjustment。 </li></ol> 3セルスフェロイドアプリケーションおよび顕微鏡フィードの同期<ol><li> 600ミクロン×600ミクロンの内側断面および120μmの壁の厚さとは別に、または長方形のホウケイ酸ガラスキャピラリー16内のグループにおける細胞スフェロイドを置きます。細胞スフェロイドの適用のための2つの技術が成功することが証明されている。 <ol><li>親指と中指で直立空のキャピラリーを取り、あなたの人差し指で上部開口を密閉する。その周囲の液体（EBSSまたは培地）における細胞スフェロイドの下部開口の近くを持参してください。上部の開口部から人差し指を離します。その中の細胞スフェロイドを持つ液体は毛管力によって、すぐに浸されます。キャピラリーのそれぞれの直立した状態で重力により充填キャピラリー内の回転楕円体の位置を調整します。 </li><li>代わりに、ピペッティングを経由して毛細血管への細胞スフェロイドを適用します。介護THAしてくださいピペットの先端の開口トン毛細管の内径の大きさ一方、以下、一方では、スフェロイドの大きさのために十分な大きさと。 </li></ol></li><li>顕微鏡検査のための特別なサンプルホルダーに、その中に回転楕円体と毛細血管を配置します。 </li><li>顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管とサンプルホルダーを取り付け、それを中心にして集中していることをこのような細胞回転楕円体の位置を合わせる。 </li><li>光学シート及び反射ミラーの位置と、シリンドリカルレンズを調整することにより、検出経路における顕微鏡対物レンズの焦点面との間のマッチングを設定し（ 図1Bの調整ねじを参照）。 </li><li>マイクロメータねじを調整して屈折率及びfishtank効果を補償する対物レンズの開口数に応じて（ 図1Bを参照）。 注：異なる屈折サンプルのインデックスとtを取り巻くメディア彼対物レンズは、対物レンズのシフトと焦点面のずれの差につながる。光シートは、対物レンズタレットによって移動されるので、光シート（対物レンズのシフトに相当）のシフトと焦点面の移動との間の不一致は、レバーアーム（ 図1Bを参照）によって補償される。マイクロメータねじは、対物レンズの開口数および屈折指数に応じて光のシートのずれを調整するために、上下のピンの間の距離を適合させるために使用される。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> 単一平面照明の図1（A）倒立顕微鏡の位置決めテーブルのベースプレートに取り付けられた単一平面照明モジュールの写真、（B）設定モジュールと焦点面と照射面との間のリフティングミスマッチ（fishtank効果）を補正する顕微鏡フィードの同期化。 Δzはoは焦点面のずれや光シートF対物レンズとΔzはのずれを示しています。インレーは毛細血管を含む回転楕円体の断面を示している。左：長方形のキャピラリー600ミクロン（壁120ミクロン）の内径。右：回転のために使用されるセットアップ。インナーラウンドキャピラリー（内径400μmの外径550μm）を、外側の長方形のキャピラリー内で回転させる。つの毛管との間の空間が液浸流体で満たされている。 動的液体環境での4。測定注：前のプロトコルは、前の細胞スフェロイドが以前にインキュベートし、次いで、単純な重力によってキャピラリー内で所定の位置に保持された測定値に静的インキュベーションのために使用される。さらにfixatiを必要としない上。ただし、動的インキュベーションとは、したがって、動的な環境を取り込み動態を測定することが望ましいメディアを流れる中の測定のために、人は、このサブプロトコルを達成することができます。 4.5から4.9のサンプルに達する気泡を避けるために重要である、ステップ。 <ol><li>内側のガラス表面への細胞スフェロイドの後の細胞接着を支持するために30分間FCSでキャピラリーを満たす。 </li><li>枯渇毛細血管内の残りのFCSコーティングは、少なくとも12時間、完全に乾くしましょう​​。 </li><li>ステップ3.2で説明したように、FCSコーティングされたキャピラリーへの細胞スフェロイドを紹介。 </li><li>回転楕円体の細胞接着を引き起こすために追加の2-4時間、5％CO 2、37℃のインキュベーター内毛細血管のままにしておきます。 </li><li>マイクロ流体システムの流入部分を設定します（ 図2を参照）。蛍光染料、薬剤または薬剤を含む培地で：チューブ（0.89ミリメートル内径）の流入を埋めるために、蠕動ポンプを使用してください。 </li><li>接気泡トラップへのマイクロ流体システムの流入部CT（ 図2を参照）。 </li><li>まず流入管に気泡のない毛細管をクランプした後、ドレーンチューブにキャピラリーの反対側をクランプします。 </li><li>チューン所望の値（ 例えば、37℃）の水浴の液温。 </li><li>希望のポンプ速度に蠕動ポンプを調整し（ 例えば、流速：9μL/分;ポンプ速度をキャピラリー中：25ミリメートル/分）。 </li><li> 、受信者（オープンループ設定）での圧送液体のいずれかを収集し、そのソース（クローズド·ループ設定）に戻すことを養うか、蠕動ポンプ（タイトクローズドループ·セットアップ）のチューブに直接供給されています</li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> 図2マイクロ流体セットアップ（オープンループとタイトなクローズドループ）;インレイ：SPHのイルミネーション倒立顕微鏡に接続された光シートベースの蛍光顕微鏡を用いたマイクロキャピラリー内eroid。 5。データ収集と解析<ol><li>レーザパワーと画像取得のための積分時間を設定する。 </li><li>ステップ5.1で定義されたパラメータは、ネイティブ細胞または蛍光色素でインキュベート以降に蛍光タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした10〜20 J / cm 2のために50〜100 J / cm 2程度の光線量値を超えないように注意してください（詳細は参考文献12を参照）光毒性を避ける。 </li><li>光シートの厚さは約10μmであるように3次元データ解析のために望ましい= 5〜10μmでΔzのにzスタックのための増分を設定します。 </li><li>細胞スフェロイド内の焦点面を変化させることによって、単一の画像またはz-スタックの測定を実行します。 </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. 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Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. 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O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams.">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li><li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy.">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).</li><li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li><li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation.">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li><li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

利害関係が宣言されていない。

現在の原稿は、光シートまたは3次元細胞システム用に最適化され、単一の平面照明顕微鏡（SPIM）デバイス、 例えば、多細胞腫瘍球（MCTS）について説明します。 3つの例示的な用途は、（1）細胞増殖抑制剤の取り込みおよび（化学療法剤の有効性への寄与はまだ評価されたまま）の分解生成物への部分的変換、遺伝的にコード化されたグルタチオンセンサの使用時によりレドックス状...

十分に確立された方法（共焦点又は多光子レーザー走査顕微鏡1-4、構造化照明顕微鏡5,6）光シート又は単一平面照明顕微鏡（SPIM）に加えて、3D撮像7,8の有益な方法であることが証明され、 9。特に興味深いのは、創薬研究10,11のためにますます使用されている3次元細胞培養、 たとえば、多細胞腫瘍球（MCTS）、への応用である。さらに、SPIMも長期暴露または反復測定値に低光用量のみ、この面が光に曝露されたサンプルの各平面を測定するためのので、サンプルの生存性を維持するために必要とされる優先的な方法である。アップ多数の面光線量和の記録時と試料12を損傷することができるように、これは、各焦点面の検出のための試料全体が点灯している他の顕微鏡技術とは対照的である。 </P&gt; シート光顕微鏡またはSPIMは、シリンドリカルレンズを使用することによって、または励起用レーザビームを走査することにより、いずれかの観察光路（総説については参考文献8を参照）に直交する方向の試料の照射に基づいている。これは多くの場合、特別なサンプルチャンバ13,14または行列を必要とし、 例えば、アガロース7,15、特別な高コスト顕微鏡で実装。これらのシステムに代わるものとしてSPIMための比較的簡単な照明装置は開発され、従来の倒立顕微鏡16（ 図1参照）に適合。約100μmの被写界深度を超える6-10ミクロンの厚さのシート光には、8mmの直径に拡張し、シリンドリカルレンズ（0.08：50ミリメートル、開口数、焦点距離）により集光されたレーザ光から構成され。サンプルは、顕微鏡対物レンズのlenの前方に配置600-900ミクロンの内径の長方形のキャピラリーに配置されている蛍光検出のための。これらの主な機能は、現在完了して保持するための蛍光検出（同一の光路に使用される（軸方向）のサンプル、照明光シートの同期調整と、対物レンズを回転させるための高度なマイクロキャピラリーアプローチを使用することによって最適化されている変位の長さは、このように、必要な数量と費用を最小限に抑え、機械的な飼料の補正）、および蛍光色素、医薬品または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応を必要とする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

簡単に、反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記述されている光シートまたは単一平面照明顕微鏡（SPIM）のためのモジュール、例えば、多細胞腫瘍スフェロイド（MCTS）。 SPIM励起モジュールの形状や試料が顕微鏡の検出経路に垂直なシート光によって照らされるように光を偏向する。システムは、照明光シートの同期調整と同様に蛍光検出のために使用される対物レンズにより、試料（また、回転用マイクロキャピラリーアプローチによって、高度なバージョンで）保持するための長方形のキャピラリーを使用することを特徴とする蛍光色素、少量の薬剤または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応による。このシステムを操作するためのプロトコルが与えられ、いくつかの技術的な詳細が報告されます。代表的な結果は、最大の（1）測定値を含む酸化剤の添加により細胞増殖抑制薬物（ドキソルビシン）と、分解生成物への部分的変換の遺伝的にコードされるグルタチオンセンサを使用することにより、（2）酸化還元測定を行い、（3）開始との阻害の際に細胞壊死のラベリングミトコンドリア呼吸鎖。既存のシステムと比較して現在のSPIMモジュールの違いおよび利点は、説明されています。

実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド 以前にインキュベートしたMCF-7細胞スフェロイド（8μMドキソルビシン、6時間）のzスタックスキャンは、図3に示されている。それは、細胞取り込みおよびドキソルビシン17の分布とその分解物18,19に関する詳細な情報を提供します。内側の回転楕円体領域に分解生成物...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

単一平面照明顕微鏡法のためのモジュール（SPIM）を容易に反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記載されている。試料は、長方形のキャピラリー内に配置され、マイクロ流体システムを介して蛍光色素、薬剤または薬物は、少量で適用することができる。

単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

9.6K ビュー.  Aalen University. 単一平面照明顕微鏡法のためのモジュール（SPIM）を容易に反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記載されている。試料は、長方形のキャピラリー内に配置され、マイクロ流体システムを介して蛍光色素、薬剤または薬物は、少量で適用することができる。 

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

工学

Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

シングルGaNナノ細線デバイスのための接触界面の解析

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

1〜2平面フロー小角中性子散乱を用いた材料の微細構造の下で流量を測定

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

その場での透過型電子顕微鏡での時間依存絶縁破壊：マイクロエレクトロニクスデバイスの故障メカニズムを理解することが可能

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

MEMS検査および特性評価のためのコンパクトなレンズレスデジタルホログラフィック顕微鏡

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

3Dバーチャルリアリティのインターフェイスを持つ走査型プローブ顕微鏡を介した単一分子のハンド制御された操作

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

ハイパー レンズ一体型顕微鏡と超解像イメージングのデモ

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

すべて電子ナノ秒分解走査型トンネル顕微鏡: 単一ドーパントの電荷ダイナミクスの調査を促進します。

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

収差補正走査透過電子顕微鏡と 1 桁台のナノメートルの電子ビーム露光

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...