This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1.細胞培養<ol><li>逆転写酵素（hTERT）ヒトテロメラーゼを使用して網膜色素上皮細胞の不死化酵素（hTERT-RPE1は、RPE1としてここで呼ばれる）。 NOTE：RPE1細胞は一般に中心小体アセンブリと繊毛形成を研究するために使用される近二倍体、非形質転換ヒト細胞である。これらの細胞は、細胞周期調節と調整通常の中心小体複製サイクルに従ってください。 </li><li>継代1においてRPE1細胞のほぼコンフルエント100ミリメートル細胞培養皿：10 mlを含む新鮮100mm皿に元の培養の5希釈DME / F-12（1：1）培地、10％ウシ胎児血清を補充した（FBS）、100 U / mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシン（完全培地をDME / F-12培地と呼ばれる）。 5％CO 2存在下、37℃で細胞を増殖させる。 <ol><li>水浴またはインキュベーター中で60℃で、振盪せずに覆われたガラスビーカー、O / Nでの1N HCl 50mlに12ミリメートルラウンドガラスカバースリップをインキュベートする。 </li><li> AF酸性溶液を廃棄terを、時々振とうしながら15分間インキュベートすることにより、蒸留水100mlに、カバースリップを3回洗浄する。 70％エタノールおよび95％エタノールで同様に洗浄を繰り返す。 </li><li>個別に60分間紫外線照射による滅菌が続くバイオセーフティキャビネット内の実験室ブロッティングペーパー、上に広げることにより、カバースリップを乾かします。 </li></ol></li><li> 35ミリメートルの細胞培養皿に2-4ドライカバースリップを置きます。細胞培養物をPBS中の25μg/ mlの濃度になるように操作された重合体（1 mg / mlのストック濃度）などのフィブロネクチンまたはフィブロネクチンの溶液を希釈する。 <ol><li>各カバースリップ上に希釈溶液の80〜100μLを置き、コーティングするために60分間カバースリップの上側をインキュベートする。完全培地を追加する前にPBSを用いて三度カバース​​リップを洗ってください。 </li></ol></li></ol> 2.成長する細胞とプロテアソーム阻害剤で処理する細胞<ol><li>通路2×10 5非同期的に成長するカバースリップを含む各35mm皿にRPE1細胞るし、2mlの完全培地中で細胞を増殖させる。新鮮予め温めておいた完全培地で培養液を24時間毎に交換してください。 <ol><li>試験タンパク質が中心体のレベルでプロテアソーム阻害の効果を分析するために（ここでVDAC3またはγチューブリン）は、44時間、2つの35mm皿で細胞を増殖させる。完全培地で培養液を交換し、それぞれ5μm以上0.05％の最終濃度で制御溶媒としてMG115またはDMSOのいずれかを追加します。同時に、40μMの最終濃度で細胞にBrdUを追加し、4時間細胞をインキュベートする。 </li><li> 24ウェルプレートの各カバースリップを転送します。各ウェルに500μlの冷メタノールを加え、10分カバースリップ上で細胞を固定するために、-20℃でプレートをインキュベートする。すぐに500μlの洗浄緩衝液（0.5mMのMgCl 2および0.05％のTriton-X 100を含む1×PBS）を用いてカバースリップを3回洗浄する。 </li></ol></li><li>残留を収穫35mm皿と遠心分離機で5分間千xgで細胞から。ウェスタンブロッティング（ステップ6）、総タンパク質を分析するために細胞ペレットを使用する。 </li></ol> 3. BrdUのパルスチェイスアッセイは、異なる細胞周期中のタンパク質レベルを分析するには<ol><li> 44時間カバーガラスを含む二つの35mm皿で細胞を増殖、細胞周期の異なる段階において中心体にタンパク質（ここでVDAC3、SAS6またはCep135）のレベルの変化を分析する。 40μMのBrdUを含む完全培地で培養液を交換し、細胞培養インキュベーター中で4時間細胞をインキュベート。 </li><li> 1皿から、ステップ2.1.2で説明したように冷メタノールを用いて細胞を固定し、24ウェルプレートにカバースリップを転送する。 </li><li> 4時間のBrdUのパルスの後、BrdUを含む培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄し、完全培地で1回、さまざまな時間（通常は別の4時間のBrdUの不在で細胞を新鮮な培地を追加し、成長するRPE1細胞）ステップ2.1.2で説明したように細胞を固定する前に。 注：RPE1細胞では、BrdU陽性細胞の大部分は、4時間のチェイスの後に遅れてSまたはG2期にある。これは、各細胞型のために独立して決定されなければならない。 </li></ol> 4.免疫染色<ol><li> 30分間（1×PBS中の2％BSA、0.1％トリトンX-100）をブロッキング緩衝液200μl中のカバースリップ上に固定された細胞をインキュベートする。 <ol><li>加湿チャンバー内で4℃でバッファー·O / Nをブロックで希釈した一次抗体（ウサギやマウスで育ち別で育った、通常1）の組み合わせで細胞をインキュベートします。 </li><li>加湿チャンバーを作るために、空の千μlのピペットチップボックスの下半分に湿ったペーパータオルを置く。ラック表面にパラフィルムのストリップを置き、インキュベートされる各カバースリップのためにパラフィルム上に抗体溶液の液滴（15〜20μl）を見つける。抗体溶液の液滴の上にカバースリップを反転（セルが浸漬されるように）とclose先端ボックスの蓋。 </li><li>再びカバースリップを反転し、24ウェル皿に戻ってそれらを返す。カバースリップを洗浄した後、室温で1時間（緑色蛍光色素結合抗ウサギおよび赤色蛍光色素結合抗マウスブロッキング緩衝液で希釈したここに）150μlの二次抗体の混合物でそれらをインキュベートする。カバーガラスを3回洗浄します。 注：フォア結合二次抗体は、光に敏感である。ステップの間に光からサンプルを保護する4.1.3-5.1.2。 </li></ol></li><li>ステップ2.1.2で説明したように、10分間-20℃で500μlの冷メタノールで再染色RPE1細胞を固定することにより抗BrdU染色のために準備します。三度カバース​​リップを洗ってください。 注：この固定は、次の工程において酸加水分解プロセスの間に、目的のタンパク質の一次および二次抗体標識を固定する。 <ol><li>室温で30分間2 N HClを200μlの細胞をインキュベートする。 1MトリスClを300μlの、pHが8で中和洗浄緩衝液を用いて細胞を3回洗浄しdは。 </li><li>再び室温で30分間ブロッキング緩衝液を200μl用いて細胞をブロックする。 </li><li>加湿チャンバー中、37℃で45分間（ブロッキング緩衝液で希釈）、ラット抗BrdU抗体で細胞をインキュベートする。バック24ウェルディッシュにカバースリップを返し、それらを洗浄した後、室温で1時間24ウェルディッシュにブロッキング緩衝液150μlの希釈された青の蛍光色素結合抗ラット二次抗体（でインキュベートする。 </li></ol></li><li>カバーガラスを3回洗浄します。ガラス顕微鏡スライド上に退色防止試薬を含むマウントソリューションの滴（約3-6μl）をスポット。取り付け溶液上に、細胞側を下にして、カバースリップを反転。優しくソフトなクリーニングティッシュを使用して、スライドに対してカバースリップを押すことにより、余分な液体を拭き取ります。顕微鏡スライド上にそれを密封するためにカバースリップのエッジに沿って透明なマニキュアを適用します。 </li></ol> 5.免疫蛍光画像Acquisitionと分析<ol><li>周囲温度で、BrdU陽性RPE1細胞の画像を取得する（1.4の開口数を有する）100Xプランアポ油浸対物レンズを使用する。 <ol><li>デジタルイメージング可能なカメラを取り付けた顕微鏡（機器を参照）にスライドを置く。各蛍光団のために、手動での実験のすべてのサンプルを検査することによって（通常は300〜1,000ミリ秒の間）、適切な露光時間を決定する。細胞の画像を取得する前に、手動でZ軸（通常は0.2μmのステップサイズ）に沿って適切な上部と下部の焦点面を決定する。デジタル顕微鏡イメージング·ソフトウェア·パッケージを使用して、Z軸に沿った異なるフルオロフォアに対して同一の露光時間を用いて、別個のカバースリップ上にある異なる試料の画像を取得する。 </li></ol></li><li> Z軸に沿って取得したすべての画像スタックの（無傍アルゴリズムを使用していないこれらの場合）デコンボリューションを行う。 <ol><li>に沿った各画像スタックの全強度投影を取得するZ軸。 </li></ol></li><li>中心体は、（2中心体の間の距離が2μm未満である）近くにある細胞では、両方の中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。 <ol><li>最初の広場を囲む大きな平方（片側通常は24〜35ピクセル）を描き、大きな正方形の選択した領域をマーク。 </li><li>領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を得る（Sは小箱を表し、Lは、大きなボックスである）。 </li><li>背景ハウエルらによって記載の式を用いて、各フルオロフォアの蛍光強度を補正し、分析29：F = F S - [（F L - F S）はS /（ - S L）×]。 </li><li>そのflのバックグラウンド補正された蛍光強度の比を計算することにより、目的のタンパク質（ここでVDAC3またはSAS6）の正規化された蛍光強度を得る（ここでγチューブリン、SAS6またはCep135）選択した内部標準用に使用される蛍光団のものとuorophore。 </li></ol></li><li>中心体が十分に分離された細胞を分析する場合には（二中心体の間の距離が2μm以上である）、箱の二つの別々のセットを描くことによって個別に中心体を分析する。各中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は15〜25ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。最初の広場を囲む大きな平方（辺あたり20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。 <ol><li>領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を取得し、ステップ5.3.3で説明したように、それぞれの中心体に別々に、各蛍光体のバックグラウンド補正された蛍光強度を算出する。 </li><li>そのセル内のそのタンパク質の合計中心体のレベルを得るために、2つの中心体からそれぞれのタンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を組み合わせる。 </li><li>入手する内部標準の合計中心体の強度、その合計中心体の強度の比を計算することにより、目的のタンパク質のための正規化強度。 </li></ol></li><li>各実験条件のために、少なくとも15〜25の細胞を分析し、スプレッドシートのグラフをプロットします。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティングを使用して総タンパク質の分析<ol><li> 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1％ノニデットP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む（RIPA）緩衝放射免疫沈降アッセイで細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする細胞を溶解する。 <ol><li>遠心分離機で10分間、10,000×gで混合、ペレット画分から溶解物を分離し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイキットを使用して、各溶解物の総タンパク質濃度を測定する。 </li></ol></li><li> 4×SDS-PAGEローディング緩衝液（50mMのトリス-Cl、pHは6.8、2％SDS、10％グリセロール、100mMのジチオスレイトール、0.1％ブロムで溶解物40μgのを混ぜるophenol青）。 <ol><li> 10分間サンプルを沸騰し、200Vの定電圧でSDS-PAGEを変性12.5％でサンプルを実行する</li></ol></li><li> （低温で1時間、90 Vの定電圧で）ウェスタンブロッティング技術を使用してニトロセルロース膜にSDS-PAGE上で分離したタンパク質を移す。 <ol><li> 1×PBS中3％脱脂乳で膜をブロックし、次いで1のため（この場合はウサギ抗VDAC3、ウサギ抗γチューブリンおよびマウス抗αチューブリン）に希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートするRTで時間。 </li><li> PBS-T緩衝液（1×PBSおよび0.2％のTween-20）を用いて膜を3回（振盪下で各5分間のインキュベーション）を洗浄した後、近赤外（IR）の混合物で膜をインキュベートする蛍光色素結合抗ウサギおよび1時間（PBS-Tで希釈した）IR蛍光色素結合抗マウス二次抗体。 </li><li>膜を3回洗浄した後、赤外線を使用してfのバンドを分析するために、膜をスキャンイムノブロット検出に適しluorescence撮像システム。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

細胞生物学における定量的な顕微鏡は、一般的に固定するための別の定量的顕微鏡アッセイを開発細胞生物の成長の例がある。しかし、 等 、（FRAP）光退色後にそのような蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、蛍光の回復などの生細胞イメージングアッセイに関連している近年の細胞27,34-36。重要なことは、中心体生物学を理解する上での進歩は、多くの場合、中心体のプールは?...

中心体は、中心体周辺物質（PCM）に囲まれた中心小体のペアで構成されています。哺乳動物細胞における主要な微小管組織化センター（MTOCs）なので、中心体は、分裂細胞における紡錘体の二つの極として機能するため、ゲノムの完全性1を維持するのを助ける。 （G0期の間、例えば 、）静止細胞では、中心体、すなわち母中心小体の二中心小体の一つは、一次繊毛、細胞表面2から突出する感覚細胞小器官を組み立てるために、基礎体に変換される。再入力する細胞周期細胞と、一次繊毛は分解され、各中心小体が徐々に成熟中心小体3を形成するために伸長するその近位端でprocentrioleの組み立てを指示する。 S期の開始時に、中心小体に9回対称性を提供する車輪のような構造は、既存の各中心小体の表面上に形成され、各procentrioleのベースとなる。 SAS6トン中心小体アセンブリは車輪4-6のハブを形成するために動員されるために帽子は不可欠である。その他centriolarタンパク質はその後、遠位方法7に高度に規制、近位側転上に組み立てられている。正確に中心小体の複製を完了した後、細胞がG2期8月末までに二つの機能の中心体を構築するために追加の中心体周辺材料を組み立てる。コアcentriolarコンポーネント9-11、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、足場成分は、膜結合タンパク質および分解機構を含むいくつかの他のタンパク質に加えて、細胞周期12-16の異なる時点で中心小体、基礎体とPCMと関連している。それは、多くの場合、多くのタンパク質の中心体のレベルが時間的に中心体標的化メカニズムおよび/または中心体におけるプロテアソーム分解によって調節されることに留意されたい。重要なことは、そのようなPLK4、MPS1、SAS6、およびCP110 A等のいくつかのタンパク質の中心体のレベルの変動細胞周期tの異なる点は、中心小体アセンブリ5,17-22を調節することが重要であると思われるが、この中心体の劣化を防止MPS1の場合には過剰な中心体19の形成につながる。一方で、いくつかのタンパク質の中心体画分は、細胞質のプールに比べて少なく不安定である。例えば、siRNA媒介ダウンレギュレーションセントリン2（Cetn2）のは、その全細胞レベル23で大幅な削減にもかかわらず、中心小体におけるタンパク質レベルの中程度の減少につながった。むしろ、それらの中心体の固有の機能を評価する際に、全細胞タンパク質レベルを測定するよりも、中心体における中心体タンパク質のレベルの変化を測定することが重要である。 本研究では、中心体でのタンパク質の相対レベルを定量化するために、間接免疫蛍光（IIF）を用いたアッセイを開発した。このアッセイは、特に、異なる試料に由来する細胞を分析するために開発されているしたがって、同時に撮像することができない。これらのサンプルは、異なる時点で採取異なる試薬（ すなわち 、薬物対コントロール）で処理した細胞であってもよい（ すなわち 、追跡対パルス）、または細胞周期の異なる段階にある。このアッセイの原理は、背景が小さな領域でタンパク質に対応する蛍光強度を補正し、そのレベルが選ばれた実験条件下で変化しない別のタンパク質に同じに対してその値を正規化するために測定することにある。中心体の生物学におけるいくつかの研究は、最近の候補タンパク質24-27の中心体の固有の機能を決定するために、両方の生細胞または固定細胞内の様々な定量的な顕微鏡技術を利用している。これらのアッセイと同様に、本技術は、試験タンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を測定する。しかし、このアッセイにおいて内部標準を使用して正規化を含めることは、おそらく大きな提供するであろう二つの異なるカバーガラス上で2つの異なるサンプルを分析の精度と信頼。また、中心体におけるタンパク質レベルを調べることに加えて、微調整して、この方法は、実験条件の多様なセットに、または他の細胞の部位に適用することができる。 ここでは、異なる細胞周期段階の細胞を比較するためのBrdUパルスチェイス戦略我々の定量的顕微鏡アッセイを組み合わせる。代わりに、様々な細胞周期の時間点を研究するために非同期的に増殖している細胞を、標準的な細胞周期停止および放出技術を使用してのS期における細胞を標識するためにBrdUでインキュベートし、標識された細胞は、種々の時間（通常は4-6時間）のために追われている。標識された細胞のほとんどは、直ちにパルスの後にS期になります。チェイスした後、標識された細胞は、のnucに対する中心体の形態学的特徴などAS-位置によって確認することができる後期S、G2または有糸分裂になるように、チェースの長さが選択されるレイ、中心体の間の距離は、 その他の染色体の凝縮したがって、チェイスの長さはS、G2、および特定の細胞型のM相の平均持続時間に依存する。このアプローチは等ヒドロキシ、アフィジコリン、ノコダゾール、細胞周期阻害剤を回避するので、より生理学的に関連する細胞周期分析を可能にする。 従って、我々は、単独で、定量的蛍光顕微鏡アッセイ、またはBrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせて、正確に非摂動細胞周期の間に候補タンパク質の中心体のレベルの相対的変化を測定するためのシンプルかつ強力な技術であることをここで実証する。我々は、これらのアッセイを用いて、VDAC3の中心体レベル、我々は最近、ミトコンドリア16,28に加えて、中心体で同定されたタンパク質を測定した。結果はVDAC3の中心体のプールが劣化することによって調節されることを我々の以前の観察を確認し、ここで得られ、また、細胞周期dependenで変化トンの方法16は 、さらに、この方法の適用性を検証する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Catalog number</td>
			<td style="width:195px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">F8141</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">DMSO</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">D2650</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">MG115</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">SCP0005</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">BrdU</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B5002</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T 6557</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aviva Systems Biology</td>
			<td style="width:99px;">ARP35180-P050</td>
			<td style="width:195px;">1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Santa cruz biotechnology</td>
			<td style="width:99px;">sc-81431</td>
			<td style="width:195px;">1:100 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab-75005</td>
			<td style="width:195px;">1:500 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-BrdU (rat monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab6326</td>
			<td style="width:195px;">1:250 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21093</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21202</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21203</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21206</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21207</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T5192</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T9026</td>
			<td style="width:195px;">1:20000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A10043</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Mouse IgG (H&#38;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td>
			<td style="width:105px;">Rockland antibodies</td>
			<td style="width:99px;">610-731-002</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">SlowFade Gold Antifade Reagent&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">S36936</td>
			<td style="width:195px;">Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Round coverslips 12CIR.-1</td>
			<td style="width:105px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:99px;">12-545-80</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Olympus IX-81 microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td>
			<td style="width:105px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:99px;">32-0082B-238</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">100X Plan Apo oil immersion objective</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;">1.4 numerical aperture</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Slidebook software package</td>
			<td style="width:105px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Odyssey IR Imaging System</td>
			<td style="width:105px;">Li-cor Biosciences</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Bicinchoninic acid (BCA) assay</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow UV cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M622</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Blue cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M643</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Green cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M663</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

中心体は、ゲノムの完全性を維持するか、または細胞中の感覚機能を容易にするための一次繊毛を組み立てるために紡錘体の極として機能し、小さいながらも重要な細胞小器官である。タンパク質のレベルは、他の.cellular場所でより中心体で異なって調節され得る、および細胞周期の異なる点でいくつかのタンパク質が中心体のレベルの変化は、中心小体アセンブリの適切な調節のために重要であると思われる。我々は、細胞周期の異なる段階において、または様々な試薬で処理した後、異なる試料からの固定された細胞における中心体におけるタンパク質のレベルの相対的変化を測定する定量的な蛍光顕微鏡アッセイを開発した。このアッセイの原理は、小さな領域でのタンパク質に対応するバックグラウンド補正後の蛍光強度を測定することにあり、そして選択された実験的なCの下で変化しない別のタンパク質のために同じに対してその測定値を正規化するondition。 BrdUのパルスと非摂動細胞周期を研究するチェイス戦略と組み合わせて、このアッセイを利用して、我々は定量的に明確に中心体でプロテアソームを介した分解による可能性が高いVDAC3の中心体のプールは細胞周期の間に中心体で規制されている我々の最近の観測を、検証しました。

我々の最近の研究ではVDAC3、ミトコンドリアのポリン16,28の1の新規中心体の局在と機能を同定した。 VDAC3特異的抗体を用いたRPE1細胞を含むいくつかの哺乳動物細胞の免疫染色は顕著な中心体染色および比較的弱いミトコンドリアの染色を示した。また、中心体VDAC3が優先母中心小体、および内因性の両方の中心体のプールに関連し、異所性にVDAC3が劣化16によって調節されて発...

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K ビュー.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

ビデオ: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

生物学

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

フライ精巣における撮像中心体

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...