Name: quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1.細胞培養<ol><li>逆転写酵素（hTERT）ヒトテロメラーゼを使用して網膜色素上皮細胞の不死化酵素（hTERT-RPE1は、RPE1としてここで呼ばれる）。 NOTE：RPE1細胞は一般に中心小体アセンブリと繊毛形成を研究するために使用される近二倍体、非形質転換ヒト細胞である。これらの細胞は、細胞周期調節と調整通常の中心小体複製サイクルに従ってください。 </li><li>継代1においてRPE1細胞のほぼコンフルエント100ミリメートル細胞培養皿：10 mlを含む新鮮100mm皿に元の培養の5希釈DME / F-12（1：1）培地、10％ウシ胎児血清を補充した（FBS）、100 U / mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシン（完全培地をDME / F-12培地と呼ばれる）。 5％CO 2存在下、37℃で細胞を増殖させる。 <ol><li>水浴またはインキュベーター中で60℃で、振盪せずに覆われたガラスビーカー、O / Nでの1N HCl 50mlに12ミリメートルラウンドガラスカバースリップをインキュベートする。 </li><li> AF酸性溶液を廃棄terを、時々振とうしながら15分間インキュベートすることにより、蒸留水100mlに、カバースリップを3回洗浄する。 70％エタノールおよび95％エタノールで同様に洗浄を繰り返す。 </li><li>個別に60分間紫外線照射による滅菌が続くバイオセーフティキャビネット内の実験室ブロッティングペーパー、上に広げることにより、カバースリップを乾かします。 </li></ol></li><li> 35ミリメートルの細胞培養皿に2-4ドライカバースリップを置きます。細胞培養物をPBS中の25μg/ mlの濃度になるように操作された重合体（1 mg / mlのストック濃度）などのフィブロネクチンまたはフィブロネクチンの溶液を希釈する。 <ol><li>各カバースリップ上に希釈溶液の80〜100μLを置き、コーティングするために60分間カバースリップの上側をインキュベートする。完全培地を追加する前にPBSを用いて三度カバース​​リップを洗ってください。 </li></ol></li></ol> 2.成長する細胞とプロテアソーム阻害剤で処理する細胞<ol><li>通路2×10 5非同期的に成長するカバースリップを含む各35mm皿にRPE1細胞るし、2mlの完全培地中で細胞を増殖させる。新鮮予め温めておいた完全培地で培養液を24時間毎に交換してください。 <ol><li>試験タンパク質が中心体のレベルでプロテアソーム阻害の効果を分析するために（ここでVDAC3またはγチューブリン）は、44時間、2つの35mm皿で細胞を増殖させる。完全培地で培養液を交換し、それぞれ5μm以上0.05％の最終濃度で制御溶媒としてMG115またはDMSOのいずれかを追加します。同時に、40μMの最終濃度で細胞にBrdUを追加し、4時間細胞をインキュベートする。 </li><li> 24ウェルプレートの各カバースリップを転送します。各ウェルに500μlの冷メタノールを加え、10分カバースリップ上で細胞を固定するために、-20℃でプレートをインキュベートする。すぐに500μlの洗浄緩衝液（0.5mMのMgCl 2および0.05％のTriton-X 100を含む1×PBS）を用いてカバースリップを3回洗浄する。 </li></ol></li><li>残留を収穫35mm皿と遠心分離機で5分間千xgで細胞から。ウェスタンブロッティング（ステップ6）、総タンパク質を分析するために細胞ペレットを使用する。 </li></ol> 3. BrdUのパルスチェイスアッセイは、異なる細胞周期中のタンパク質レベルを分析するには<ol><li> 44時間カバーガラスを含む二つの35mm皿で細胞を増殖、細胞周期の異なる段階において中心体にタンパク質（ここでVDAC3、SAS6またはCep135）のレベルの変化を分析する。 40μMのBrdUを含む完全培地で培養液を交換し、細胞培養インキュベーター中で4時間細胞をインキュベート。 </li><li> 1皿から、ステップ2.1.2で説明したように冷メタノールを用いて細胞を固定し、24ウェルプレートにカバースリップを転送する。 </li><li> 4時間のBrdUのパルスの後、BrdUを含む培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄し、完全培地で1回、さまざまな時間（通常は別の4時間のBrdUの不在で細胞を新鮮な培地を追加し、成長するRPE1細胞）ステップ2.1.2で説明したように細胞を固定する前に。 注：RPE1細胞では、BrdU陽性細胞の大部分は、4時間のチェイスの後に遅れてSまたはG2期にある。これは、各細胞型のために独立して決定されなければならない。 </li></ol> 4.免疫染色<ol><li> 30分間（1×PBS中の2％BSA、0.1％トリトンX-100）をブロッキング緩衝液200μl中のカバースリップ上に固定された細胞をインキュベートする。 <ol><li>加湿チャンバー内で4℃でバッファー·O / Nをブロックで希釈した一次抗体（ウサギやマウスで育ち別で育った、通常1）の組み合わせで細胞をインキュベートします。 </li><li>加湿チャンバーを作るために、空の千μlのピペットチップボックスの下半分に湿ったペーパータオルを置く。ラック表面にパラフィルムのストリップを置き、インキュベートされる各カバースリップのためにパラフィルム上に抗体溶液の液滴（15〜20μl）を見つける。抗体溶液の液滴の上にカバースリップを反転（セルが浸漬されるように）とclose先端ボックスの蓋。 </li><li>再びカバースリップを反転し、24ウェル皿に戻ってそれらを返す。カバースリップを洗浄した後、室温で1時間（緑色蛍光色素結合抗ウサギおよび赤色蛍光色素結合抗マウスブロッキング緩衝液で希釈したここに）150μlの二次抗体の混合物でそれらをインキュベートする。カバーガラスを3回洗浄します。 注：フォア結合二次抗体は、光に敏感である。ステップの間に光からサンプルを保護する4.1.3-5.1.2。 </li></ol></li><li>ステップ2.1.2で説明したように、10分間-20℃で500μlの冷メタノールで再染色RPE1細胞を固定することにより抗BrdU染色のために準備します。三度カバース​​リップを洗ってください。 注：この固定は、次の工程において酸加水分解プロセスの間に、目的のタンパク質の一次および二次抗体標識を固定する。 <ol><li>室温で30分間2 N HClを200μlの細胞をインキュベートする。 1MトリスClを300μlの、pHが8で中和洗浄緩衝液を用いて細胞を3回洗浄しdは。 </li><li>再び室温で30分間ブロッキング緩衝液を200μl用いて細胞をブロックする。 </li><li>加湿チャンバー中、37℃で45分間（ブロッキング緩衝液で希釈）、ラット抗BrdU抗体で細胞をインキュベートする。バック24ウェルディッシュにカバースリップを返し、それらを洗浄した後、室温で1時間24ウェルディッシュにブロッキング緩衝液150μlの希釈された青の蛍光色素結合抗ラット二次抗体（でインキュベートする。 </li></ol></li><li>カバーガラスを3回洗浄します。ガラス顕微鏡スライド上に退色防止試薬を含むマウントソリューションの滴（約3-6μl）をスポット。取り付け溶液上に、細胞側を下にして、カバースリップを反転。優しくソフトなクリーニングティッシュを使用して、スライドに対してカバースリップを押すことにより、余分な液体を拭き取ります。顕微鏡スライド上にそれを密封するためにカバースリップのエッジに沿って透明なマニキュアを適用します。 </li></ol> 5.免疫蛍光画像Acquisitionと分析<ol><li>周囲温度で、BrdU陽性RPE1細胞の画像を取得する（1.4の開口数を有する）100Xプランアポ油浸対物レンズを使用する。 <ol><li>デジタルイメージング可能なカメラを取り付けた顕微鏡（機器を参照）にスライドを置く。各蛍光団のために、手動での実験のすべてのサンプルを検査することによって（通常は300〜1,000ミリ秒の間）、適切な露光時間を決定する。細胞の画像を取得する前に、手動でZ軸（通常は0.2μmのステップサイズ）に沿って適切な上部と下部の焦点面を決定する。デジタル顕微鏡イメージング·ソフトウェア·パッケージを使用して、Z軸に沿った異なるフルオロフォアに対して同一の露光時間を用いて、別個のカバースリップ上にある異なる試料の画像を取得する。 </li></ol></li><li> Z軸に沿って取得したすべての画像スタックの（無傍アルゴリズムを使用していないこれらの場合）デコンボリューションを行う。 <ol><li>に沿った各画像スタックの全強度投影を取得するZ軸。 </li></ol></li><li>中心体は、（2中心体の間の距離が2μm未満である）近くにある細胞では、両方の中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。 <ol><li>最初の広場を囲む大きな平方（片側通常は24〜35ピクセル）を描き、大きな正方形の選択した領域をマーク。 </li><li>領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を得る（Sは小箱を表し、Lは、大きなボックスである）。 </li><li>背景ハウエルらによって記載の式を用いて、各フルオロフォアの蛍光強度を補正し、分析29：F = F S - [（F L - F S）はS /（ - S L）×]。 </li><li>そのflのバックグラウンド補正された蛍光強度の比を計算することにより、目的のタンパク質（ここでVDAC3またはSAS6）の正規化された蛍光強度を得る（ここでγチューブリン、SAS6またはCep135）選択した内部標準用に使用される蛍光団のものとuorophore。 </li></ol></li><li>中心体が十分に分離された細胞を分析する場合には（二中心体の間の距離が2μm以上である）、箱の二つの別々のセットを描くことによって個別に中心体を分析する。各中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は15〜25ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。最初の広場を囲む大きな平方（辺あたり20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。 <ol><li>領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を取得し、ステップ5.3.3で説明したように、それぞれの中心体に別々に、各蛍光体のバックグラウンド補正された蛍光強度を算出する。 </li><li>そのセル内のそのタンパク質の合計中心体のレベルを得るために、2つの中心体からそれぞれのタンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を組み合わせる。 </li><li>入手する内部標準の合計中心体の強度、その合計中心体の強度の比を計算することにより、目的のタンパク質のための正規化強度。 </li></ol></li><li>各実験条件のために、少なくとも15〜25の細胞を分析し、スプレッドシートのグラフをプロットします。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティングを使用して総タンパク質の分析<ol><li> 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1％ノニデットP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む（RIPA）緩衝放射免疫沈降アッセイで細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする細胞を溶解する。 <ol><li>遠心分離機で10分間、10,000×gで混合、ペレット画分から溶解物を分離し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイキットを使用して、各溶解物の総タンパク質濃度を測定する。 </li></ol></li><li> 4×SDS-PAGEローディング緩衝液（50mMのトリス-Cl、pHは6.8、2％SDS、10％グリセロール、100mMのジチオスレイトール、0.1％ブロムで溶解物40μgのを混ぜるophenol青）。 <ol><li> 10分間サンプルを沸騰し、200Vの定電圧でSDS-PAGEを変性12.5％でサンプルを実行する</li></ol></li><li> （低温で1時間、90 Vの定電圧で）ウェスタンブロッティング技術を使用してニトロセルロース膜にSDS-PAGE上で分離したタンパク質を移す。 <ol><li> 1×PBS中3％脱脂乳で膜をブロックし、次いで1のため（この場合はウサギ抗VDAC3、ウサギ抗γチューブリンおよびマウス抗αチューブリン）に希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートするRTで時間。 </li><li> PBS-T緩衝液（1×PBSおよび0.2％のTween-20）を用いて膜を3回（振盪下で各5分間のインキュベーション）を洗浄した後、近赤外（IR）の混合物で膜をインキュベートする蛍光色素結合抗ウサギおよび1時間（PBS-Tで希釈した）IR蛍光色素結合抗マウス二次抗体。 </li><li>膜を3回洗浄した後、赤外線を使用してfのバンドを分析するために、膜をスキャンイムノブロット検出に適しluorescence撮像システム。 </li></ol></li></ol>

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Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

細胞生物学における定量的な顕微鏡は、一般的に固定するための別の定量的顕微鏡アッセイを開発細胞生物の成長の例がある。しかし、 等 、（FRAP）光退色後にそのような蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、蛍光の回復などの生細胞イメージングアッセイに関連している近年の細胞27,34-36。重要なことは、中心体生物学を理解する上での進歩は、多くの場合、中心体のプールは?...

中心体は、中心体周辺物質（PCM）に囲まれた中心小体のペアで構成されています。哺乳動物細胞における主要な微小管組織化センター（MTOCs）なので、中心体は、分裂細胞における紡錘体の二つの極として機能するため、ゲノムの完全性1を維持するのを助ける。 （G0期の間、例えば 、）静止細胞では、中心体、すなわち母中心小体の二中心小体の一つは、一次繊毛、細胞表面2から突出する感覚細胞小器官を組み立てるために、基礎体に変換される。再入力する細胞周期細胞と、一次繊毛は分解され、各中心小体が徐々に成熟中心小体3を形成するために伸長するその近位端でprocentrioleの組み立てを指示する。 S期の開始時に、中心小体に9回対称性を提供する車輪のような構造は、既存の各中心小体の表面上に形成され、各procentrioleのベースとなる。 SAS6トン中心小体アセンブリは車輪4-6のハブを形成するために動員されるために帽子は不可欠である。その他centriolarタンパク質はその後、遠位方法7に高度に規制、近位側転上に組み立てられている。正確に中心小体の複製を完了した後、細胞がG2期8月末までに二つの機能の中心体を構築するために追加の中心体周辺材料を組み立てる。コアcentriolarコンポーネント9-11、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、足場成分は、膜結合タンパク質および分解機構を含むいくつかの他のタンパク質に加えて、細胞周期12-16の異なる時点で中心小体、基礎体とPCMと関連している。それは、多くの場合、多くのタンパク質の中心体のレベルが時間的に中心体標的化メカニズムおよび/または中心体におけるプロテアソーム分解によって調節されることに留意されたい。重要なことは、そのようなPLK4、MPS1、SAS6、およびCP110 A等のいくつかのタンパク質の中心体のレベルの変動細胞周期tの異なる点は、中心小体アセンブリ5,17-22を調節することが重要であると思われるが、この中心体の劣化を防止MPS1の場合には過剰な中心体19の形成につながる。一方で、いくつかのタンパク質の中心体画分は、細胞質のプールに比べて少なく不安定である。例えば、siRNA媒介ダウンレギュレーションセントリン2（Cetn2）のは、その全細胞レベル23で大幅な削減にもかかわらず、中心小体におけるタンパク質レベルの中程度の減少につながった。むしろ、それらの中心体の固有の機能を評価する際に、全細胞タンパク質レベルを測定するよりも、中心体における中心体タンパク質のレベルの変化を測定することが重要である。 本研究では、中心体でのタンパク質の相対レベルを定量化するために、間接免疫蛍光（IIF）を用いたアッセイを開発した。このアッセイは、特に、異なる試料に由来する細胞を分析するために開発されているしたがって、同時に撮像することができない。これらのサンプルは、異なる時点で採取異なる試薬（ すなわち 、薬物対コントロール）で処理した細胞であってもよい（ すなわち 、追跡対パルス）、または細胞周期の異なる段階にある。このアッセイの原理は、背景が小さな領域でタンパク質に対応する蛍光強度を補正し、そのレベルが選ばれた実験条件下で変化しない別のタンパク質に同じに対してその値を正規化するために測定することにある。中心体の生物学におけるいくつかの研究は、最近の候補タンパク質24-27の中心体の固有の機能を決定するために、両方の生細胞または固定細胞内の様々な定量的な顕微鏡技術を利用している。これらのアッセイと同様に、本技術は、試験タンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を測定する。しかし、このアッセイにおいて内部標準を使用して正規化を含めることは、おそらく大きな提供するであろう二つの異なるカバーガラス上で2つの異なるサンプルを分析の精度と信頼。また、中心体におけるタンパク質レベルを調べることに加えて、微調整して、この方法は、実験条件の多様なセットに、または他の細胞の部位に適用することができる。 ここでは、異なる細胞周期段階の細胞を比較するためのBrdUパルスチェイス戦略我々の定量的顕微鏡アッセイを組み合わせる。代わりに、様々な細胞周期の時間点を研究するために非同期的に増殖している細胞を、標準的な細胞周期停止および放出技術を使用してのS期における細胞を標識するためにBrdUでインキュベートし、標識された細胞は、種々の時間（通常は4-6時間）のために追われている。標識された細胞のほとんどは、直ちにパルスの後にS期になります。チェイスした後、標識された細胞は、のnucに対する中心体の形態学的特徴などAS-位置によって確認することができる後期S、G2または有糸分裂になるように、チェースの長さが選択されるレイ、中心体の間の距離は、 その他の染色体の凝縮したがって、チェイスの長さはS、G2、および特定の細胞型のM相の平均持続時間に依存する。このアプローチは等ヒドロキシ、アフィジコリン、ノコダゾール、細胞周期阻害剤を回避するので、より生理学的に関連する細胞周期分析を可能にする。 従って、我々は、単独で、定量的蛍光顕微鏡アッセイ、またはBrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせて、正確に非摂動細胞周期の間に候補タンパク質の中心体のレベルの相対的変化を測定するためのシンプルかつ強力な技術であることをここで実証する。我々は、これらのアッセイを用いて、VDAC3の中心体レベル、我々は最近、ミトコンドリア16,28に加えて、中心体で同定されたタンパク質を測定した。結果はVDAC3の中心体のプールが劣化することによって調節されることを我々の以前の観察を確認し、ここで得られ、また、細胞周期dependenで変化トンの方法16は 、さらに、この方法の適用性を検証する。

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock of 1 mg/ml in water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF blocking buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&amp;nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rat monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H&amp;amp;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland antibodies</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Round coverslips 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 numerical aperture</td></tr><tr><td>Slidebook software package</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

中心体は、ゲノムの完全性を維持するか、または細胞中の感覚機能を容易にするための一次繊毛を組み立てるために紡錘体の極として機能し、小さいながらも重要な細胞小器官である。タンパク質のレベルは、他の.cellular場所でより中心体で異なって調節され得る、および細胞周期の異なる点でいくつかのタンパク質が中心体のレベルの変化は、中心小体アセンブリの適切な調節のために重要であると思われる。我々は、細胞周期の異なる段階において、または様々な試薬で処理した後、異なる試料からの固定された細胞における中心体におけるタンパク質のレベルの相対的変化を測定する定量的な蛍光顕微鏡アッセイを開発した。このアッセイの原理は、小さな領域でのタンパク質に対応するバックグラウンド補正後の蛍光強度を測定することにあり、そして選択された実験的なCの下で変化しない別のタンパク質のために同じに対してその測定値を正規化するondition。 BrdUのパルスと非摂動細胞周期を研究するチェイス戦略と組み合わせて、このアッセイを利用して、我々は定量的に明確に中心体でプロテアソームを介した分解による可能性が高いVDAC3の中心体のプールは細胞周期の間に中心体で規制されている我々の最近の観測を、検証しました。

我々の最近の研究ではVDAC3、ミトコンドリアのポリン16,28の1の新規中心体の局在と機能を同定した。 VDAC3特異的抗体を用いたRPE1細胞を含むいくつかの哺乳動物細胞の免疫染色は顕著な中心体染色および比較的弱いミトコンドリアの染色を示した。また、中心体VDAC3が優先母中心小体、および内因性の両方の中心体のプールに関連し、異所性にVDAC3が劣化16によって調節されて発...

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K ビュー.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

ビデオ: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

生化学

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

神経科学

ヒト初代細胞における核タンパク質染色の解析ワークフロー

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

著者スポットライト:免疫蛍光アッセイを用いたヒト細胞の可塑性と環境適応性を調査するための包括的なエピジェネティック解析(英語)

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

遺伝学

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

フライ精巣における撮像中心体

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

生物学

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

要約

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グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

シナプス蛍光の自動定量

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

フライ精巣における撮像中心体

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド