ここでは、免疫蛍光、共焦点顕微鏡、およびコンピュータベースの分析を用いて、参照タンパク質に対するシナプスタンパク質の分布を決定するプロトコルについて説明する。我々の方法は、絶対蛍光レベルではなく比を用いて免疫蛍光染色の固有の変動性を回避する。さらに、この方法を使用すると、異なるレベルでのタンパク質分布の不均一性を分析することができます。
脳全体のスライスから脳領域、海馬の異なる層などのサブ領域まで。この技術は、マウス以外の脳およびモデル系以外の異なる組織におけるタンパク質分布を決定するために適応することができる。原稿に記載されているように、以前に単離された固定されたマウス脳を洗浄することから始めます。
その後、脳を30%スクロース0.1モルPBで15ミリリットル反応チューブに移します。クライオは、脳を48時間、または沈むまで摂氏4度でインキュベートします。その後、関心のある領域に応じてクライオ保護脳をトリミングするために鋭い刃を使用します。その後、クライオ型に脳を配置し、それを埋め込むために最適な切断温度化合物を追加し、泡を避け、切断のコロナ平面を持つように脳を適切に向けます。
氷結型をマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、固形物を凍らせるまで置きます。凍結した組織をクライオミクロトームに取り付け、セクションの少なくとも15分前に待ってミクロトーム温度に平衡化します。25マイクロメートルの厚いコロナスライスに脳を切断し始めます。
脳組織に触れることなく、慎重に最初のスライスのOCTにガラスフックを使用してください。OCT はガラスフックにくっつきます。最初の井戸に脳のスライスを転送するためにガラスフックを使用してください。
0.1モルPBで満たされた24ウェルプレートにウェルあたり3つの隣接スライスを収集します。スライスは最大2週間染色されるまで摂氏4度で保管します。免疫染色のためのスライスを準備するには、脳スライスに描画することなく、1つの井戸からPB溶液を除去するためにプラスチックピペットを使用しています。その後、1000マイクロリットルのピペットを使用して、250マイクロリットルの新鮮なPBを追加して、余分なOCTを洗浄します。
スライスを乾燥させないように、その時に井戸ごとにこの洗浄を繰り返します。次に、プラスチック製のピペットを使用して、PB溶液を第1のウェルから除去します。1000マイクロリットルのピッドを使用して、よく働く井戸あたり250マイクロリットルのブロッキングバッファを再びうまく働かします。
シェーカーの室温でプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション中に、反応管に1ウェルあたり250マイクロリットルの抗体バッファーを加える。次に、2マイクロリットルのピペットを使用して、適切な量の抗体を溶液に直接ピペット化し、数回軽く上下にピペットして混合します。
次に、この希釈抗体をボルテックスして適切な混合を確認できない。プラスチック製のピペットでブロッキングバッファーをうまく取り除き、井戸当たり250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。一晩で摂氏4度でシェーカーにプレートをインキュベートします。
翌日、プラスチック製のピペットで抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの洗浄バッファーを1ウェルあたり1回1回洗浄し、各1回10分間を室温でシェーカーで洗浄します。洗浄中、暗闇で働き、蛍光体を反応管内で2番目の抗体に対して、一次抗体と同じ方法で希釈する。
洗浄が完了した後、プラスチックピペットで洗浄バッファーを除去し、ウェルあたり250マイクロリットルの二次抗体溶液を添加する。室温で暗闇の中で90分間インキュベートします。完成後、プラスチックピペットで抗体溶液を除去します。
洗浄バッファー1と同じ方法で洗浄バッファー2でセクションを3回洗浄します。この洗浄の間に希釈DAPIは0.1モルPBで、1〜2000濃度を達成した。プレートから洗浄バッファーを取り出した後、250マイクロリットルのDAPI溶液を加え、シェーカー上の室温で5分間インキュベートする。
プラスチックピペットでDAPI溶液を除去した後、1000マイクロリットルのピッドを使用して、1ウェルあたり0.1モルPBの500マイクロリットルを追加します。顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細かいブラシを使用して、スライドに0.1モルPBの3つの別々の滴を追加します。
ブラシを使用すると、スライド上のドロップごとに1つのスライスを配置し、スライスを平らにして方向を付けます。すべてのスライスが正しく配置された後、紙のティッシュを使用して余分なPBを除去し、スライスを完全に乾燥させることなく慎重に乾燥させます。その後、スライドに埋め込み培地の80マイクロリットルを追加し、慎重に脳のスライスを埋め込むためにカバースリップでそれをカバーします。
スライドを覆って光の露出を避け、煙のフードで1〜2時間乾燥させ、共焦点顕微鏡の準備ができるまで4°Cの顕微鏡スライドボックスに保管します。原稿に記載されているように異なるチャネルのための全体の脳スライスの仮想組織を取得した後、ファイルをクリックしてフィジーにすべての単一のチャンネルまたは1つの画像をロードし、その後開きます。次に、自由な手の選択ツールを使用して、DAPI チャネル内の 1 つの半球を線分化します。
編集をクリックしてから選択し、マスクを作成して、選択した領域のマスクを作成します。次に、分析をクリックし、粒子を測定して、単一チャネルの平均蛍光強度を決定します。各チャンネルの平均蛍光強度値を決定するために、単一のチャンネルを選択することを確認します。
その後、単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。対象領域における単一チャネルの平均蛍光強度を決定するために、フリーハンド選択ツールで領域を線引する。核脳の切片を染色するDAPIで染色した後、細胞密度が低い領域よりも、穿刺パターンと高い細胞密度の領域が明るくなります。
Mover抗体による染色は、シナプトフィシンがより均質な分布を明らかにした脳全体の明るいホットスポット領域と調光領域を有する不均一な分布を明らかにした。画像のオーバーレイは、シナプトフィシンを示す緑色蛍光と比較したMoverタンパク質を示す赤色蛍光の差分布を示した。定量分析後、半球および対象領域にわたる異なるチャネルの蛍光強度値が、MoverとSynaptophysinの両方について決定された。
シナプトフィシン蛍光値に対する引越し物蛍光値の比率は、シナプス小胞に対する高い、低いMoverレベルの領域を有するMoverの不均一な分布を示す。相対的なMoverの豊富さ半球全体と比較して関心のある1つの領域の比率とパーセンテージに翻訳された割合は、平均に対する1つの関心領域にどれだけのMoverが存在するかを示した。相対的な移動量は、海馬のサブフィールド内の異なる層について決定された。
対象となる3つの領域は、それぞれの層の比と対応する半球の比率を比較することによって定量化される。この手順は、簡単に適応し、追加の目的のタンパク質の細胞内分布を決定する追加の超分解能顕微鏡などの異なるイメージング技術と組み合わせることができます。この技術は、遺伝子組み換えや薬物処理動物などの異なるモデルシステムにも適用できます。
これにより、異なる実験条件または種間の比較アプローチが可能になります。
