We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

注：プロトコルの3つの部分幼虫蚊、繁殖力の効果を研究するための雌成虫に対するDZNepの血液ベース露光DZNep薬物の水性曝露を記述し、DZNepによるSAH加水分解酵素の阻害は、単純な比色法を用いて測定。これらのアッセイの概略図を図1に示されている。 1.未熟モスキート開発·サバイバーシップアッセイ注：このセクションでは、蚊の幼虫の発達と生存に影響を与える水溶性薬物の使用を説明しています。 <ol><li>ハッチA. 28℃でのハマダラカの卵蒸留水（DH 2 O）で2 回目の幼虫にリアそれらを。 </li><li> 6ウェルDNアーゼ、RNアーゼを含まない細胞培養プレートを取り、各ウェルに10ミリリットルのdH 2 Oに注ぐ。 </li><li> 2 番目の齢で蚊の幼虫を選択して、ウェル当たり15の幼虫を追加します。プレートに第 2齢幼虫を追加する前に、P過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオル上にUT。 </li><li>実験をランダム化するために色分けされたテープでラベルの井戸。各プレート上の試験濃度につきラベル2のウェル（ 図2）。 </li><li>のdH 2 O 1ml中に0.3mgのDZNepを溶解して1mMのDZNep塩酸塩（MW = 298.73）ストック溶液を調製し0.5μMおよび5.0μMの最終濃度を達成するために標識ウェルにDZNep.HClの原液を追加します。 注：ストック溶液は4で保存することができる °短期間のためのC（月に1日）または-20 長期（1ヶ月より長い）のため°C。 注：上記の濃度原液の添加はかなり井戸の水の体積を変更しません。しかし、より高い濃度の場合には、化合物の任意の不必要な希釈を避けるために、幼虫の培地中で化合物を溶解することが望ましい。 </li><li>各ウェルにフレーク魚の餌を等量加える。プレートカバーsおよび28でそれらをインキュベートする インキュベーター内のC°。 </li><li> 24時間の曝露期間後のDZNep処理および未処理幼虫蚊の死亡を記録します。デッド幼虫を削除し、捨てる。すべての幼虫が死ぬか、蛹になると大人として浮上するまで、毎日この録音を繰り返します。それらは蛹化まで、幼虫のサイズ二日毎、 すなわち、0日目、2、4、6、8を記録する。 </li><li>十分な統計分析ソフトウェアを使用して幼虫の発育と死亡率のデータを分析します。 注：棒グラフは、Microsoft Excelの死亡率データを表すために使用することができる。多変量分散分析（MANOVA）は、JMPやSPSSなどのソフトウェアを用いて行っ蚊の幼虫の有意差が生存中の薬物の結果、異なる用量の場合、明らかになります。 </li></ol>メスの蚊に人工フィーダーを通して薬物を投与2.産卵検定注：このセクションでは、血液aに薬物を添加詳細ndは人工フィーダシステムを使用して、成体雌の蚊に給餌。 <ol><li>対照および試験ケージのためのオスとメスの蚊の数と同じ数を持つ大人の蚊のケージを設定します。メスまで両方のケージにコットンボールに浸し、10％の糖液を提供する（3〜5日はハマダラカのために最適です）供給するための準備ができている。 </li><li>血液供給に先立って2時間、女性は空腹であることを確認するためにコットンボールを削除します。 </li><li>反転した幅広の底ガラス漏斗（直径= 50ミリメートル、長さ= 70ミリメートル）と産業接着剤で密封し、周囲のプラスチックで構成されて2つの人工血液フィーダーを組み立てます。流入と水の流出用のコネクタを介して2つのフィーダ「アウトレット（直径= 10ミリメートル）にプラスチックチューブ（直径= 7 mm）を取り付けます。 「コントロール」と、2つのフィーダをラベル「5μMDZNep。」 </li><li>市販の発熱体を使用すると、給餌のためのプログラムを設定。 「メニュー」の「設定」に進みます。と「セットポイント」を選択します。プリロード·プログラムが表示されます。 「SP1」を選択し、37のための温度を設定する °C。 注：発熱体を投与血液が一定の温度に維持されることを保証する。追加プログラムの設定は、別の蚊や虫の種のために使用することができる。 </li><li>水でバケツを記入し、水の中に発熱体を浸す。 </li><li>パラフィルムの正方形の一枚（50ミリメートル×50 mm）をカットし、薄い膜状のフィルムを作ってそれを伸ばす。パラフィルム人工フィーダの下部をカバーしています。パラフィルム（50ミリメートル×10ミリメートル）の別の部分をカット、それを伸ばし、フィーダのエッジをシールする。 </li><li>管によってフィーダと発熱体を接続し、システムを組み立てます。完了すると、システムのスイッチを入れると、「SP1」を選択します。プレスシステムを起動するために &quot;Enter&quot;を。 注：水が37に加熱した取得します C°、その温度で維持した。 </li><li>目のモニター水バケツで温度計を用いて水の電子温度。 注：コネクタおよびチューブは、血液の温度は37のままであるように、システムを通る水の一定の循環を維持するのを助ける °C。 </li><li>すべての血液の流出を除染するために使用される10％の漂白剤溶液との平底トレイを記入してください。 </li><li>マイクロ遠心チューブに除細動羊の血液の2ミリリットルを追加します。 「コントロール」としてラベルを付けます。静かにそれを数回反転させることにより、血液や薬剤を混ぜて &quot;5μMDZNep」と記された実験的なチューブに（ステップ1.5を参照）&quot; 5μMDZNep「DZNep原液の.Add 6μLとしてラベル実験的なチューブのためのプロセスを繰り返します。 RTでチューブ10分間インキュベート。 </li><li>ピペットを用いて、それに応じてラベルフィーダの先頭に制御し、試験血液を2ミリリットルを追加します。漂白剤溶液中にピペットを捨てる。暗い袋でケージをカバーし、Fを奨励するために定期的にケージに空気を吸う供給のためemales。 </li><li>蚊が約30分間食べてみましょう。送りが完了すると、フィーダを取り出し、加熱素子のスイッチを切り、パラフィルムストリップ。約5分間漂白溶液中でフィーダーを浸し、脱イオン水で十分にすすぐ。 </li><li>フィーダを取り外し、48時間ケージに砂糖水でコットンボールを置く。産卵を促進するために一晩ケージ内で水とろ紙を含む卵料理を置きます。それぞれの試験または対照濃度の各卵料理にラベルを付けます。 </li><li>翌日卵料理を取り外し、ステレオ顕微鏡下で卵の数と構造を調べる。 Q-colors5ソフトウェアを使用して画像を得る。卵の数を数えます。試験および対照ケージから得た卵の数の差を分析します。 注：対応のないt検定は、卵の数は、（ページ≤0.05）有意に異なるかどうかを決定するために使用することができる。 </li></ol>モスキート酵素阻害3.生化学分析薬物による注：このセクションでは、成人男性と女性の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を測定するための指標としてDTNBを用いた酵素活性アッセイを説明しています。 <ol><li>のdH 2 Oを1Lにし、Na 2 HPO 4の14.19グラムを添加することによって、0.1MのNa 2 HPO 4（二塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製次に、のdH 2 Oを1LにのNaH 2 PO 4の13.79グラムを添加することによって、0.1MのNaH 2 PO 4（一塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製</li><li> pHを8.5に0.1 MのNaH 2 PO 4溶液を用いて、0.1MのNa 2 HPO 4溶液を滴定する。 注：これは、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中のワーキングストック溶液になります。 </li><li> 0.3％トリトンX-100を添加することにより、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の均質溶液を調製する。 NOTE：均質化溶液は、4℃。で保存することができる。 </li><li> PRepare 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでSAHの6.15ミリグラムを溶解することによって、1.6 mMのSAH（MW = 384.4）ソリューション。 </li><li> 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでDTNBの6.3 mgの溶解して1.6 mMのDTNB（MW = 396.4）溶液を調製する。使用するまで氷上で新鮮なDTNBソリューションを保管してください。 </li><li> 1ミリリットルのdH 2 OにDZNepの0.3 mgの溶解して1mMのDZNep.HCl（MW = 298.73）溶液を調製次に、のdH 2 Oで0.002μM、1,000μMから一連の濃度に1mMのDZNep溶液を希釈</li><li> DZNepによってSAH加水分解酵素の阻害を測定するために、蚊の粗酵素抽出液を調製し、0.3％トリトンX-を含む、氷冷した0.1 MのNaH 2 PO 4（pH8.5）中の1mlの10非血液給電成体の蚊をホモジナイズ100、ガラス組織ホモジナイザーを使用して。 1.5ミリリットルの微量遠心チューブにホモジネートを転送します。 </li><li> 4℃で万×gで5分間ホモジネートを遠心。クリーンに上清を移し1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。 SAH生化学分析のための酵素源として上清を使用してください。 </li><li>空白の治療（ すなわち 、DZNep、酵素なし）の場合、50μlの1.6 mMのSAH、96ウェルの個々のウェルに50μlの1.6 mMのDTNB、および100μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5の）を追加、平底マイクロプレート。 </li><li>コントロール（ すなわち 、DZNep）のために、個々に50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中と50μlの酵素（粗抽出物から得SAH加水分解酵素）を追加井戸。 </li><li> DZNepトリートメントには、50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの酵素と個々のウェルにDZNep濃度選択した50μlを添加する。治療群と対照あたり4回の反復を準備します。 </li><li> 96ウェルマイクロプレートリーダーを用いて20秒間隔で5分間、405nmでSAH酵素サンプルの光学密度（OD）を読み取る。 </li><li>制御AからブランクODを引きND治療ODは各ウェルから得た。以下の式を用いてSAH加水分解酵素活性の残存率の計算：％残留活性=（処置OD /対照OD）×100。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルの適用が成功に不可欠ないくつかのステップがあります。幼虫のアッセイのために、注意が正しくラベルを付け、各試験濃度を複製するために注意が必要です。試験サンプルをランダム化し、それぞれの試験ウェルに薬物の所定量を添加して設定し、この実験の重要な部分である。 96ウェルマイクロプレートに第 2齢蚊の幼虫を追加する前に、それぞれの幼虫は、過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオルを置くことができる。乾燥を防ぐために、幼虫はすぐに鉗子の鈍ペアを使用してマイクロプレートウェルに転送する必要があります。これは、各ウェルマイクロプレート中の水の体積を確保し、意図したように、薬物の濃度が残る。自分の体の長さを測定するために、幼虫を転送する場合には、静止して維持するために、数分間氷上で幼虫を置くことが推奨される。異なる化合物は、このプロトコルを適応させる際に、注意が各々に加えストック溶液の量を決定するために注意が必要うまく。このような場合には、直前に各ウェルマイクロプレートに幼虫を添加する水の中の化合物の計算された量を溶解するのに良いかもしれない。 吸血アッセイのために、それは蚊が、実験の前に砂糖水を少なくとも2時間を除去することにより、適切に飢えていることが不可欠です。これを怠ると、不完全な供給および成人女性産卵にほとんど影響することがあります。 DZNepを溶解するために数分かかりますように完全に混合し、血液中の薬物の均一な分布が、同様に重要なステップである。薬剤処理された血液がすぐに送られた場合、DZNepは均等に蚊のシステムに分散されません。ことを強く除細動血液がより良い結果を得るために（抽出日から週未満のIE）新鮮であることをお勧めします。 興味のある化合物との生化学的アッセイの成功に不可欠な複数のステップがあります。このプロトタイプで使用される各ストック溶液の濃度<html> colはDZNepに最適化されています。異なる化合物のためのプロトコルを適応させるために、我々は、最も信頼性の高い結果を決定するために、異なるpH、SAH、DTNB濃度および昆虫サンプルサイズの範囲を試験示唆する。粗酵素抽出物の製造は、この手順の中で最も時間のかかるステップです。ホモジネートの準備中には、吸光度の読み取りを妨げる可能性が上清中に存在する脂質として、以上10大人の蚊を使用することをお勧めします。この問題を回避するには、（単一チャネルマイクロピペットを用いて）、上清中の脂質の最上層は、ステップ3.8の後に除去することができる。上清をきれいな微量遠心管に転送する必要があります。ステップ3.8は、残りの粘性の脂質を廃棄するように繰り返されるべきである。残りの透明な上清をすべてのチューブからプールし、穏やかに混合されなければならない。マルチチャンネルピペットをウェルにSAHを追加する効率を高めるために使用することができる。 DTNBアッセイにおける指標として使用され、そして最後に調製し、氷上に維持されるべきである。 NT &quot;&gt;このプロトコルは、蚊の異なるライフステージ上の化合物の効果をテストするための簡単​​な手順をユーザに提供します。しかし、いくつかの制限がこのプロトコルを使用することがある。この手法は、DZNepの水への溶解度に主に依存します。未熟幼虫は、その周囲の媒体中に溶解された薬物に曝露される。試験される化合物は、水性媒体中で不溶性である場合、それはあまり効率的で、このプロトコルをレンダリングしてもよい。生殖能力を試験するために、我々は、除細動ヒツジ血液中に溶解した薬物に成人女性を行った。このラボ（ すなわち、蚊を供給するためのマウスやモルモットを使用しています）を直接哺乳類の血液に蚊のコロニーをもたげている場合は不可能である。 この記事で詳述異なるアッセイの組み合わせは、昆虫には、水溶性化合物の効果を試験する新規な方法をユーザに提供する。 DZNepは、主に癌研究のためのin vitroでの細胞系に添加される。しかしながら、このプロトコルは、uのを可能にSERは生体内で昆虫のさまざまなライフステージ上の任意の影響を調べた。さらに、それはまた、毒物学アッセイのためのステップバイステップのガイドラインに従って研究を提供する。現在の文献では、知識は昆虫上のエピジェネティックな薬物の効果に関して制限されている。例としてDZNepを用いて、潜在的な昆虫制御剤などの他のエピジェネティック薬または新規な化合物を探索するに向かって、前提条件のステップとして利用することができる手順を提供する。このプロトコルは、マラリア蚊のために開発されているが、他の蚊または昆虫種において、DZNepの効果、または目的の任意の水溶性化合物を試験するように適合され得る。

マラリアは世界で昆虫関連死亡の最大数を担当しています。推定2.19億例は、主にアフリカ1において約66万人が死亡、その結果、世界中で毎年起こる。協調した努力にもかかわらず、マラリアプログラムはいくつかの課題に直面しています。殺虫扱わ蚊帳とプログラムの屋内残留噴霧フォームキーコンポーネントが、地元住民の殺虫剤抵抗性は、これらの取り組み2を妨げる。殺虫剤抵抗性の蚊の個体数の急速な増加は、主に彼らの環境の変化に迅速に適応し、異なるニッチ3,4,5を悪用するマラリア蚊の能力に起因する。殺虫剤抵抗性の既存のメカニズムを克服するために、新規殺虫剤の目標と次の世代の化合物の探索が保証されています。マラリアmの様々なライフステージに実験的な殺虫剤の有効性を決定するための簡単​​な、ステップバイステップのプロトコルosquitoesが大幅にこれらの取り組みを強化するだろう。 細胞株および動物モデルでの薬物作用の薬理学的研究は、細胞および生物の遺伝学と生理学を調節するために有用なツールとしてのエピジェネティックな薬の使用を確立している。 DNAメチル化およびヒストン修飾は、基礎となるDNA配列6を変更することなく、多細胞生物における遺伝子発現に影響を与える2つのエピジェネティックなメカニズムである。メチル化などの翻訳後修飾は、細胞の完全性および遺伝子発現を維持する上で重要な役割を果たし、7,8,9、いくつかの基本的なプロセスに影響を与え得る。いくつかの昆虫種の研究は、卵形成を含むプロセスにおいてエピジェネティクスの重要性を強調し、細胞維持10と同様に、投与量補償11幹いる。しかし、病気のベクターにおけるそのような態様は、まだ調査されるべきである。蚊にこのシステムを調節する化合物を使用することで私たちを提供することができ新規殺虫剤のターゲット経路にスポット。 3-デアザネプラノシンA（DZNep）は、種々のタイプの癌への影響が12,13,14,15,16が研究されている既知のヒストンメチル化阻害剤である。 DZNepは間接的に、ヒストンのリジンのN -メチルトランスフェラーゼを阻害する安定な水溶性エピジェネティック薬（EZH2）、哺乳動物細胞におけるポリコーム抑制複合体2（PRC2）のコンポーネントです。 PRC2は、多細胞生物における幹細胞の増殖の調節において重要な役割を果たし、ヒストンメチル化はPRC2媒介遺伝子サイレンシングの重要な側面である。免疫不全マウスでは、DZNepで前処理した細胞は、17以下で腫瘍形成性であることが示されている。この薬剤は、EZH2が18関与する非アルコール性脂肪肝疾患などの他の疾患を研究するために使用されるようになっている。 DZNep、確立されたのS -adenosylhomocysteine（SAH）加水分解酵素阻害剤19、20である。におけるSAH加水分解酵素の阻害SAHの蓄積と、今度は、利用可能なメチル供与基を制限することにより、メチルトランスフェラーゼ活性の阻害をもたらす。 SAHは、その代謝経路において昆虫を含む多くの生物によって利用されるアミノ酸誘導体である。最近の研究では、低用量でDZNepは休眠に影響を与え、昆虫21での開発を遅らせる可能性があることを示している。 ここで、蚊の様々なライフステージ上の水溶性化合物の効果を調査するための堅牢なプロトコルが開発されている。このプロトコルの3つの部分が未熟蚊、成人の血液供給用メス、および成体雄および雌の蚊の酵素活性に対する水溶性化合物の効果を検査するための命令を含む。まず、DZNep未熟蚊の発達および生存を研究するために水に溶解する。これは、薬物曝露の10倍の増加から生じる差異を比較するためつの濃度で行われる。大人のメスの蚊に対する薬物の効果を調べるために、DZNep除細動ヒツジ血液に添加し、雌に人工的に血液が供給される。続いて、繁​​殖力に対する薬物の結果を検討する。最終的に、酵素活性アッセイは、成体雄および雌の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を決定する指標として、5,5&#39;-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を使用して実行される。このプロトコルは、マラリア蚊、 ハマダラカで開発されているが、それは容易に蚊や他の昆虫の任意の種における目的の化合物の効果を研究に適合させることができる。このプロトコルで詳述の技術は、効率的に水または水性媒体中で限られた、または全く溶解度を有する薬剤に適用されない場合があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

殺虫剤耐性マラリア制御プログラムの主要な問題を提起する。蚊はマラリアは熱帯諸国で遍在する問題を制御すること、すぐに環境の変化の広い範囲に適応させる。殺虫剤抵抗性の集団の出現は、媒介蚊の制御のための新規薬剤標的経路及び化合物の探索を保証します。エピジェネティック薬はよくしかし多くの昆虫への影響について知られていない、がん研究に確立されている。この研究は、マラリア媒介、 ハマダラカに、3-デアザネプラノシンA（DZNep）、癌治療のための実験的なエピジェネティック薬の毒性効果を調べるための単純なプロトコルを提供します。化合物は、治療を制御するために相対的な成体の蚊の繁殖を減少に対し、死亡率およびサイズ​​の減少の濃度依存的増加が、DZNepに露出未熟蚊で観察された。また、S中の薬物依存的な減少があった-治療を制御するためDZNepの相対への曝露後に蚊におけるアデノシル（SAH）加水分解酵素活性。これらのプロトコルは、順番に、水溶性のエピジェネティック薬または化合物の毒性効果を探索するためのユニークな多面的なアプローチを実証し、実験的な薬剤に対して複数の毒性学的エンドポイントを評価するためのシンプルな、ステップバイステップの手順で研究者を提供し、媒介蚊や他の昆虫に対する関心。

図1は、アッセイの略図である。それはこの資料に記載されている手順のさまざまな手順について説明します。プロトコルは蚊の異なるライフステージに基づいているように、ここで詳細な実験のために、次にすべき特定のシーケンスはありません。ユーザは、サンプルの可用性に依存して、同時に、1つ又は複数のアッセイを実施することを選択することができる。 図2は、未成熟な蚊の開発と生存アッセイのためにセットアップするプレートを示しています。試験濃度及び反復の数は、ユーザの要件および薬物のアベイラビリティに応じて変更することができる。未熟蚊アッセイのために、DZNepの1mMストック溶液は、0.5μMおよび薬物を含まない集団を含有するウェルを有する対照パンと一緒に5μMの最終濃度を達成するために蚊を含む水に添加した。実験は、その多くの幼虫と蛹survを実証したDZNep処理したウェルにおけるよりも対照ウェルにived。 図3は、実験中のマラリア蚊の全体的な生存に対するDZNepの効果を示す。結果は、エピジェネティック薬DZNepは成長と発展を抑制し、未熟蚊の死亡率を誘導することを示している。 5μMに暴露された個体の数が多いとは対照的に8日目に死亡したのに対し、0.5μMにさらさ蚊の大半は、実験の10日目に死亡し、対照治療（薬物なし）で蚊の死亡率が残った影響を受けないと、いくつかの実験の8日目に大人として登場。逆の関係は、薬物濃度及び蚊ボディサイズ（ 図4）との間で観察された。 図5は 、蚊の繁殖力に対するDZNepの効果を示す。 DZNepを含む血液が供給される大人のメスの蚊は、重要なreductioを示した実行可能な卵の数ではn。 図5（a）は、制御用ケージ（薬物なし）から得た卵を示している。 図5Bは試験ケージから得た卵を示しています。試験ケージから得られた卵の数が多い色で暗くであり、正常な血液供給メスの蚊（ 図6）から得られた卵と比較した場合、フロート（exochorionの空気で満たされた拡張）を欠いていた。暗い色の卵と一緒に山車の不在はexochorion形成におけるエピジェネティクスの潜在的な役割を示している。 図7は 、成人男性と女性のマラリア蚊におけるSAH加水分解酵素活性に対するDZNepの効果を実証する。 ODにおけるDZNep依存的減少がDZNepはSAH加水分解酵素活性を阻害することを示す制御処理（薬物なし）と比較した各薬物治療のために観察される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig1highres.jpg" wid番目= &quot;700px&quot; /&gt; 図1：マラリア蚊にエピジェネティック薬を使用するアッセイの略図スキームの左部分は未熟蚊を使用して開発し、生存アッセイを示しています。中央部は、血液の供給大人の雌に薬物を経由して繁殖力アッセイを示しています。右側の部分は、薬物による酵素阻害の生化学的アッセイを示している。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig2highres.jpg" /> 図2：プレートが未熟蚊の開発と生存アッセイを描いた 「C」マーク対照ウェルにラベルを付けます。。ラベル &quot;0.5&quot;は0.5μMDZNepでウェルを示しています。ラベル「5」は5μMDZNepと井戸を示している。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig3highres.jpg" /> 図3： </st栄&gt; マラリア蚊の生存に対するDZNepの効果。濃度依存死亡率が未熟蚊で観察される。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig4highres.jpg" /> 図4：未熟蚊の開発にDZNepの影響（A）幼虫制御処理（サイズ= 5ミリメートル）から0.5μMDZNep（= 4ミリメートルサイズ）で処理された（B）幼虫5で処理された（C）幼虫。。。 μMDZNep（サイズ= 3ミリメートル）。すべての幼虫は、実験の同日に測定した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig5highres.jpg" /> 図5：蚊の産卵数に対するDZNepの効果対照治療（薬物なし）蚊が卵の非常に大きな数（A）を含まないコンパから卵料理。5μMDZNep（B）で処理した雌の卵料理と赤。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig6highres.jpg" /> 図6：顕微鏡下で見たマラリア蚊卵構造上のDZNepの効果。 （A）卵制御処理からの（薬物なし）蚊は山車とロゼット様集合を表示する。（B）卵を5μMDZNepの欠如の山車とロゼット様集合で処理された蚊から。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52041/52041fig7highres.jpg" /> 図7：。マラリア蚊におけるDZNepによるSAH加水分解酵素阻害 DZNepは対照治療（薬物なし）と比較してODの減少を引き起こす。

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K ビュー.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

ビデオ: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

生物学

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

遺伝子組換え蚊を使用してマラリアやデング熱の拡大防止

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

より良い蚊の構築：A. gambiaeとA.ネッタイシマカ蚊のマラリアとデング熱の抵抗を使用可能にする遺伝子を特定

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...