この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの卵巣濾胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離することです.卵胞は卵巣の基本単位であり、卵母細胞および周囲の濾胞細胞からなる。これは、濾胞細胞の一次捕獲および遺伝子発現、すべての飽和および体外受精の上昇を含むよく研究政策のための濾胞細胞および外のコンパートメントの両方を分離するための広い用具である。
最近、ゼブラフィッシュは既に開発の制御を研究する日産の強力なモデルとなっています。ここでは、単純な方法を提示するので、ゼブラフィッシュの既に発達の調査を容易にするゼブラフィッシュ濾胞の濾胞細胞と卵母細胞を分離する商業、塊、または濾胞細胞に関する2つの分離とスピンのすべての側面は、迷路を有するポストを使用しており、時間がかかり、外部に高い損傷を与えた。ここでは、純粋なサンゴ礁の下でタメラレートを使用するか、または一部のガラスを使用して2つの別々のコンパートに簡単な方法を確立しました。
私たちのメトロスコープは、外側と濾胞細胞の両方が引っ張られたガラスの毛細管を入力することによって容易に製造することができる。まず、詩人のガラス毛細血管を準備します。アルコールバーナーにガラス毛管の頭を打つ。
ガラスキャピラリーをレイブカードの直径まで伸ばすには、4つの側面を使用します。第二に、成体雌魚から過剰に食い込む排剖は、卵巣から卵巣卵胞を単離する。最後に、ポーリングされたガラス毛細管を使用して、卵胞細胞と卵母細胞を卵巣卵胞から分離します。
ガラスキャピラリー、シャープ容器、十分なカッター、アルコールバーナー、鉗子を準備します。アルコールバーナーを横にし、キャピラリーのグラスを家に持ち帰り、アルコールバーナーの火の上にガラス毛細血管の一端を加熱します。鉗子を使用してガラス毛細血管の別の端を保持し、ガラスの毛細管を素早く優しく強調します。
ガラスの廃棄物をシャープ容器に入れます。ガラスでプールに十分なカッターGretchを使用してください。その後、穏やかに鉗子によって遮断し、ポートの視線の滑らかな開口部を作るために、すぐにアルコールバーナーにガラス毛細血管の端を数回燃やし、十分なカッターで開いた端を慎重にこすります。
栽培された水系から魚の水槽を取る方法。そして今、魚がギルの動きを止めるまで、少なくとも2〜5分間氷水の上に魚を置くことによって、大人の女性を結び付けます。氷箱から魚を取り出し、残りの水魚体をタオルで取り除き、4セットのDセクションプレートに魚を置いた。
魚は死を確実にするために鋭いはさみを使ってスパンコードを提供することによって首を切られた。はさみを解剖して次のように切ります。クロエから腹部の正中線に沿ってエラに切り取られた脱剖は、クロエの土手から切り取り、前先端から後側に切り取った。
体の片側の皮膚と筋肉を穏やかに取り除き、内臓を露出させ、4つのステップで健康な卵巣全体を取る。卵巣を培養中の100ミリメートルに直ちに穏やかに入れ、容器60%L50中央値を容器に入れた。異なる段階の卵巣卵胞の大きさと形態に基づいて透過光光学で解剖顕微鏡を送った。
4セットを争うビールを使用して、これらの卵巣卵胞を手動で分離する。分離された卵巣卵胞を収集し、60%L 50培地を含む別の培養皿に入れて、素敵な孤立した卵巣卵胞は、濾胞細胞および卵母細胞を分離するために使用される。次に、分離用のデバイスを設定します。
30センチメートルのプラスチックチューブを使用してください。一端はフィルター要素と1ミリリットルのピペット先端と接続される。別の端は200マイクロリットルのピペットの先端と接続される。
ディセッティング顕微鏡の下で、口を使って気流を制御し、欠陥のある人がガラス毛細血管でプールに移動し、ガラスの毛細血管から毛先を吹き飛ばします。この過程の間に、卵巣卵胞の濾胞細胞および卵母細胞は分離され得る。これは成熟した段階の卵胞のための分離プロセスである。
吸入の過程の間に、濾胞細胞層は卵母細胞から剥離され、濾胞細胞と卵母細胞を吹き出した後に分離することができる。これは完全な地面の段階の毛包である。卵胞細胞層が卵母細胞から切り離されているのがわかります。
この方法は、初期の卵巣卵胞にも適用することができる。これはラテッラ創世の段階の真ん中の卵胞です。これは初期のバテラ創世の段階で卵胞です。
これはバタバラ創世前の段階での卵胞です。この写真から、分離のプロセスを見ることができます。パネル1は、完全に成長したステージパネルで無傷の卵胞を示しています。
パネル2は、引っ張られたガラス毛細血管へのこの卵胞のアンギュレーションを示しています。パネル3は、引っ張られたガラス毛細血管から濾胞が吹き出されたことを示しています。パネル4は、正常な分離F裸卵細胞および濾胞細胞を示す。
この方法でも、卵母細胞における濾胞細胞の分離は、異なる段階の卵胞で行うことができる。濾胞細胞が無傷の卵胞から分離されたかどうかを調査する。そのまま卵胞とは、BV段階からFG段階に異なる段階の卵胞から卵母細胞を分離し、DAPIで染色した。
濾胞細胞の核は、DAPIによって染色することができる。DAPIの青色信号は、無傷の卵胞では観察されたが、これらの異なる段階の卵胞ではウーサイトを否定しなかった。さらに明確な分離を確認するために、無傷の卵胞と分離された卵母細胞は組織学的セクションにガットしていました。
DAPI記載の結果は、濾胞細胞が明確に除去され、oocytesを否定したことを示した。この方法を用いて、完全に成長した段階の卵胞から分離された裸卵母細胞は、自発的な卵母細胞成熟を受けることが判明した。4時間のインキュベーション後に何の治療もせずに。
水で活性化した後、これらの成熟した卵母細胞は、完全な絨毛の拡張を受けることができます。この結果は、この方法を使用して、Oocyte への低い損傷を示します。このように, このマスタードは、ゼブラ魚の卵母細胞成熟した配給を研究するための裸の卵母細胞を得るために使用することができます..
毛包への物質の濾胞層は毛細管ガラス管によって除去することができる。これらは受精し、孵化段階に移すことができる。この結果は、この方法がゼブラ魚の体外受精に使用できることを示唆している。
ここでは、シマウマ魚卵巣卵胞から濾胞細胞と卵母細胞を迅速かつ容易に分離するための新しい方法を説明する。この方法には、いくつかの重要な利点があり、方法論が覆されています。これらの中でも一次的に、単一および外部操作のみが必要となるため、分離の容易さを大幅に向上させることである。
分離の容易さの増加は、マイクロ解剖に熟練していない研究者にこの方法の可用性を高める。第二に、この方法は、卵巣卵胞の濾胞細胞と卵母細胞を分離するために使用することができ、PV、EBV MV段階を含む、そのような分離は、現在の方法論を用いて初期段階の卵胞で行うことが出来ない。第三に、この新しい方法は、卵母細胞への損傷を減らします。
この方法によって分離された裸の卵母細胞は、卵母細胞成熟を受けることができ、受精することができる。また、この方法は他の魚にも適用できます。
