Name: fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-µcp) and sequential nucleophilic substitution
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1.生成エラストマースタンプ<ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMSスタンプのシリコンマスターを生成するには、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用したフォトマスクの特徴パターンを設計します。 <ol><li> 300μmの内径（ID）および1200ミクロンの中心から中心までの間隔が600μmの外径を持つ年輪の20×20のアレイとしての第1のパターンを設計します。 </li><li> 600μmのIDおよび1200μmの中心から中心までの間隔が900μmの外径を持つ年輪の20×20アレイのような第二のパターンを設計します。 </li><li>さらに、45°の角度で1200ミクロンの中心から中心までのコーナーパターンから離れ、各アレイ設計のすべての四隅に1×1mm 2の正方形の基準マークを配置。 </li><li>他の場所15またはマイクロ流体ファウンドリと共同で詳述標準的なリソグラフィ技術を用いて300μmのフィーチャーの深さに相関する、1アスペクト比：1この実験で使用するための、シリコンマスターを製作。 注：フィーチャーが100μmの基板表面と接触する前にスタンプの異常変形につながる可能性がより低いと深さ。 注：このプロトコルは、すでに作成に特殊な装置やクリーンルームを必要とするフォトレジストの記載されたパターンをシリコンマスターを取得したことから始まります。それは、これらのパターン化されたマスターを作成するために製作者や中核施設と相談するのが最善です。 </li></ol></li><li> Silanizeシリコンマスター（トリデカフルオロ-1,1,2,2- tetrahydroocty）トリクロロシラン蒸気とのインキュベーションにより、O / N。 注：シラン蒸気は非常に有毒であり、唯一の化学ドラフト内で処理する必要があります。 </li><li> PDMSプレポリマーと、60℃でペトリ皿、O / Nでシラン化シリコンのマスターの上に硬化剤PDMSの1の比率：10を硬化させることにより、シリコンの巨匠の逆レプリカを作成します。 </li><li>シリコンマスターからPDMSスタンプを外し、アクリロニトリル·ブタジエン·スチレンへのスタンプ（ABS）バッキングまたはその他の剛性材料を接合接着剤を使用してね。 注：選択した材料は、透明または生体適合性である必要はない。しかし、それはロボットのツーリングとPDMSよりも剛性とのインタフェースのための平坦な表面を提供する必要があります。 </li></ol> 2.準備カバースライド<ol style="margin-left: 40px;"><li>穏やかな窒素気流下エタノールを用いてリンスして乾燥される前に1分間、アセトン、トルエン、メタノールおよび超音波処理で顕微鏡カバースライドをすすぎ（24ミリメートル×50ミリメートル＃1）。 注：唯一の化学ヒュームフード内でトルエンとアセトンを処理します。 </li><li>集束電子ビーム蒸着器を用いて、18.0ナノメートルの金（Au）が続く〜3.5 nmのチタン（Ti）と被覆カバースライド。 注：この手順では、シリコン、ポリスチレンなどの金コーティング、種々の基材と互換性があります。それは、これらはオンサイト生成することが可能であるが、金被覆基材は、商業供給業者を介して入手可能である。 注：基板上のAu層であるべきままのTi層は、3nm以上厚さでなければならないトン以上厚さ5nmと最終基板16,17の理想的な光学特性に応じて厚さが1ミリメートルにするすべての方法を範囲とすることができる。基板は、製造のための光学的に透明である必要はない。しかしながら、製造された基板の顕微鏡分析を容易にする。 </li><li>使用直前に穏やかな窒素下でエタノールとドライと金コートカバースライドをすすぐ。 </li></ol> 3. R​​-μCP外環の<ol style="margin-left: 40px;"><li>選択的に準拠した多関節ロボットアーム（SCARA）システムとのR-μCPする前に、システムのソフトウェアを使用して、ロボットのツールエフェクターおよび付随するデュアルカメラシステムのキャリブレーションを行います。 注：これらの用具は、 図1に描かれている。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> 図1. R-μCPシステムとロボットアームツーリング。 </sチョン&gt;（A）は、すべてのツールと備品付きのR-μCPシステムの大規模ビュー、（a）は、真空チャック、（b）は、試薬槽、（c）は下向きのカメラ、（d）のスタンプネスティング·フィクスチャ、（e）のロボットツール。 （B）〜（h）のABS担保PDMSスタンプを保持し、（f）は、ダイヤモンド先端エッチングツールと、（g）の空気圧吸引ツールを描いたロボットアーム工具。 <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li>手動で600μmのIDと900μmのODは年輪がスタンプネスト固定具に下向きに突出したPDMSスタンプを置く。手動図1Aに表示された真空チャックの上に新たに洗浄金被覆coverslideを置き、結合ラボ真空を使用して固定する。 </li><li>ロボットコントロールを使用して、 図2Aに示すように、金被覆coverslideの中心点の上に下向きにカメラを合わせる。 注：この時点では、最初に目視検査によって定義することができ、PDMSスタンプは非常にラーグであるため、高い精度を必要としない金コートスライドよりえー。 </li><li> 4つの基準をエッチングするためにロボットアームを指示する &quot;X&quot;の寸法を有する正方形の頂点のマークをロボットアームに取り付けられたダイヤモンド先端エッチングツールを使用して金被覆coverslideを中心に3.8ミリメートル3.8 mmの（ 図2Bに描かれ、自動化されたプロセス） 注：これは、すべての4つの基準マークが下向きにカメラのいずれかの視覚的なフレーム内にあるようにします。 </li><li>ロボットの空気圧吸引ツールを使用して、アップを拾うと、PDMSは、図2Cのようにスタンプネスティング·フィクスチャ上の1ミリメートルをスタンプ保持する。 （自動プロセス） </li><li> 図2DおよびEに描か上向きにカメラとLED照明リングを使用して、スタンプの正方形の基準マークを視覚化し、タイムスタンプの平均値X、Yを決定するために、カメラのソフトウェアで10回、それらを識別し、および角度は、中心からオフセットロボット工具軸。 （自動プロセス） </li><li>のように、 <strong&gt;図2Aは、視覚化し、ロボット工具軸の中心からずれcoverslideの平均X、Yの中心位置および角度を決定するためにcoverslideのエッチングされた基準マークを10回検出するように下向きにカメラを使用する。 （自動プロセス）。 注：内部計算が正確に整列させるロボットシステムのソフトウェアによって実行されるスタンプの及び将来のR-μCPステップでカバースリップのX、Yの中心位置および角度オフセット。 </li><li> 図2Fに示されるように3.8）アルカンチオールATRP開始、ω-カプトブロモイソブチレート（エタノール中の2mM）の浴にスタンプを置きます。 （自動プロセス） </li><li>アルカンチオール溶液からスタンプを削除し、 図2Gのように、エタノールを蒸発させるために0.48バール（5 PSI）に加圧し窒素流の上に置きます。 1分後、窒素気流の圧力が均一な乾燥を確実にするために1.03バール（15 PSI）にある増加。 （自動化されたプロセス） 注：不完全な乾燥は、パターン忠実度の全部または一部が失われます。 </li><li>乾燥させた後、金被覆スライドの計算された中心位置の上にスタンプを移動し、 図2Hに示すようにZ軸モータ力を監視しながら、100μmの増分でそれを下げる。 注：これは、Z軸モータによって経験ロボットガイダンスソフトウェアに表示されてトルクとして伝達される。 （自動プロセス） </li><li> 79.2キロパスカルの所定の圧力が達成された後、スタンプを下げ停止し、15秒間、金でコーティングされたスライドとの接触を維持する。 （自動プロセス） NOTE：ここで、圧力値は、現在のスタンプの設計及び機能の高さのために最適化される。スタンプの設計は、試行錯誤プロセスによってこれらの相応特に高アスペクト比のスタンプ、チューニングのために、変更された場合。 </li><li>ゆっくりと金コートスライドからスタンプを削除し、バックスタンプネスティングフィクスチャ内のスタンプを置く。 （自動プロセス） </li></オール&gt; 4.マイクロパターンカバースライド上PEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li>マイクロパターンcoverslideを保持する真空圧力を解放し、50ミリリットルのシュレンクフラスコに移す。シール及び脱気シュレンクは、真空ポンプを用いてフラスコ。 </li><li>追加のマクロモノマーPEGMEMA（208.75ミリモル）、水（34.4ミリリットル）、メタノール（43.8ミリリットル）、銅（II）ブロミド（1ミリモル）、及び2 &#39;、2ビピリジン（3ミリモル）を含むATRP反応混合物5.5mlのシュレンクフラスコ。 </li><li>反応を開始するために、水中でL-アスコルビン酸ナトリウム（454.3ミリモル）0.5 mlを加え、それが不活性ガス下、RTで16時間続けることができる。 注： 図3A-Bに示すようにL-アスコルビン酸ナトリウムの添加に続いて、反応の色が暗褐色に光が緑色からシフトする。 注：反応は16時間を超えて継続することができますが、それはかなりのPEGブラシの長さを増加させることはありません。 </li></ol><imgALT =「図3」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; SI-ATRPの開始図3（A）反応およびL-アスコルビン酸ナトリウムを添加した後、（B）以降の色の変化の開始。 SI-ATRP手順に従ってマイクロパターンcoverslide表面の（C）の顕微鏡画像。スケールバー1ミリメートル。 <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li>シェンクフラスコからマイクロパターンcoverslideを取り外して、穏やかな窒素気流下エタノール、水、エタノール、乾燥ですすいでください。 NOTE：SI-ATRPに続いて、表面改質は、目に見えるべきであり、 図3Cのように、顕微鏡下で画像化し、分析することができる。 注：これは、それが基質を免疫染色する必要がなくなるように裁判の精度をテストするための最も簡単な方法です。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMA鎖の5アジド官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> N 6 mlを加え、反応バイアルを100 mMのアジ化ナトリウムを含有するN-ジメチルホルムアミド（DMF）。 24時間37℃で、この反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMFを処理します。アジ化ナトリウムを秤量する場合は注意が必要です。 </li><li>完了後、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを除去し、窒素気流下エタノールを水と乾燥をすすぐ。 </li></ol>臭素官能化PEGMEMA鎖の6パッシベーション<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中の微細化coverslideを置きます。 </li><li> 100mMのエタノールアミンと反応バイアルに300mMのトリエチルアミンを含有するジメチルスルホキシド（DMSO）を6mlを加える。 24時間40℃で、この反応を開催しています。 注：唯一の化学ドラフト内で、DMSO、エタノールアミン、トリエチルアミンを処理します。 </li><li>完了するとマイクロパターンcoverslを削除反応バイアルからのIDEは、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol>内環の7、R-μCPとPEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3.12300μmのIDと小さな特徴を持つ年輪が以前にマイクロパターン年輪の内側に配置されるように年輪を突出600μmの外径とPDMSスタンプに置き換えて、 - 以前のステップ3.2および3.6で説明したように、R-μCPステップを実行する。 注：このスタンプ用の圧力閾値が132.0キロパスカルである。前述のように、これらの圧力設定は、この実験で使用されているタイムスタンプ機能のために最適化される。 </li><li> 4.4 - 以前のステップ4.1で説明したように、SI-ATRPステップを実行。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMAチェーン8.アセチレン官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> 100 mMのDMSOを含有する6mlのを追加します。反応バイアルにプロパルギルアミン。 24時間室温でこの反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMSOおよびプロパルギルアミンを処理します。 </li><li>完了時に反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを削除し、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol> 9.銅触媒」をクリックして &quot;アセチレンのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li>硫酸銅（15ミリモル）/トリス[（1-ベンジル1 H -1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（TBTA、30ミリモル）を6ml（1を加える：1（v / v）の水反応バイアルを562μMアジドPEG 4 -Biotinコンジュゲートを含む/ DMF）。反応を初期化するために混合物に、水中のL-アスコルビン酸（0.15ミリモル）1.2 mlを加え。 </li><li> 10秒間反応液を通してバブル窒素を、パラフィルムでバイアルを密封し、RTで24時間反応させる。 </li><li> completio時にnは、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを取り除くには、水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に入れてください。 </li></ol>ビオチン化アセチレン基の10。免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li>ブロックは、RTで1時間DPBS（10％ロバ血清）でcoverslideを微細化。 RTで2時間DBPSでストレプトアビジン546コンジュゲート（2μg/ ml）を（PBS中3％ロバ血清）とビオチン化アセチレン基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回すすいでください。 注： 図4Bは、このステップが完了した後、スライドの画像を示している。 </li></ol> 11.銅を含まない」をクリックして &quot;アジのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端注：必要に応じて、この基板改質工程は、細胞培養中にその場で行うことができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12ウェルPにマイクロパターンcoverslideを残すDBPS以下olystyrene皿リンス。 </li><li> 20μMのDBCO-PEG 4 -Biotinを含むDBPS（または細胞培養培地）の2ミリリットルを追加し、この反応は室温で24時間継続することができ（またはインキュベータ内で37℃）。 </li><li>完了後、DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回リンス（または単にメディア変更を実行する）。 </li></ol>ビオチン化アジド基の12免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li> RTで2時間2ミリリットルのDPBS中ストレプトアビジン488コンジュゲート（2μg/ ml）を（3％ロバ血清）とビオチン化アジド基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間マイクロパターンcoverslideのDPBS中5回すすいでください。 </li><li>画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いてcoverslideマイクロパターン。この工程が完了した後の図4A-Cは 、スライドの画像を示している。 NOTE：組織培養アッセイのための基質を使用する場合、セクション10と、このプロトコルの12をスキップ。希望degre後に官能化のeは、窒素気流下、100％エタノール及び乾燥両面を洗浄することによって操作coverslideを滅菌する。無菌の生物学的安全キャビネットにスライドを移し、細胞播種と文化を進める前に、PBSで5回のスライドをすすぎます。 </li></ol>

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	<li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology:+Current+Applications+and+Future+Perspectives.">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li><li>Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood.">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li><li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Pursuit+of+Zero:+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins.">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li><li>Rozkiewicz, D. I., Ja&#324;czewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click&#8221;+Chemistry+by+Microcontact+Printing.">Click&#8221; Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li><li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology.">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li><li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes.">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li><li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD&#8212;Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">RGD&#8212;Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li><li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays.">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li><li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Self-Assembled+Monolayers:+Efficient,+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology.">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li><li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li><li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Fouling&#8221;+Oligo(ethylene+glycol)-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Non-Fouling&#8221; Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li><li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment.">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li><li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling.">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).</li><li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+robotic+microcontact+printing+(R-&#956;CP)+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm.">High-precision robotic microcontact printing (R-&#956;CP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning.">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures.">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li><li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo(ethylene+glycol)+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold.">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li><li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

組織工学のための理想的な基質は、バイオインスパイアードし、それにより、ネイティブの組織内で発見の重要な生理活性リガンドの空間分布を再現することになる。彼らはまた、リガンドの時間的な調整およびそれらが向け組織形態形成および細胞運命の空間的に制限された誘導を可能にするために提示される空間パターンを可能にする動的な特性を有するであろう。このような基板の製?...

同時に非ファウリング本来の特性を維持しながら、共有結合した生化学的リガンドを表示するために、PEGグラフト化表面の能力は、それらの培養基材1,2,3上のエンジニアリング·カスタムマイクロスケール環境のための理想的な選択肢となっています。リガンドコンジュゲートしたPEGブラシにより媒介される生物特異的相互作用は、個々の細胞の表現型上の生体内組織の微小環境において 、複雑な内に見られる生化学的手がかりの効果の還元主義分析を可能にします。さらに、バイオ直交性の「クリック」化学は、それらが天然のコンフォメーション4-6に示されているように、リガンドの方向性固定化を容易にすることができる。このように、PEGのマイクロスケールの空間パターニングは、固定化された生化学的手がかり6,7により誘導される細胞のシグナル伝達を研究するためにインビトロニッチでデザイナーを作成するための汎用性の高いツールですブラシ。 生化学立方の空間パターンを生成するための一般的な方法ESは、PEG共役アルカンチオールのパターンを有するマイクロコンタクト·プリンティング（μCP）金でコーティングされた基材を必要とする。その後、PEG化アルカンチオールの自己組織化単分子膜（SAM）マイクロパターンは、生化学分子の物理吸着を制限例えば、タンパク質、基板のみ8,9の非パターン化領域への。しかし、この技術によって生成されたSAMは、長期細胞培養培地中で酸化に敏感である。したがって、SAMは、アルカンチオールμCP&#39;dは、しばしば他の部位の非ファウリングの安定性10を増加させるために表面開始原子移動ラジカル重合（SI-ATRP）を用いて、PEGポリマーブラシをグラフトされる。具体的には、アルカンチオール重合開始剤のμCP、ω-meraptoundecylブロモイソブチレート、ポリSI-ATRP続いて金被覆表面上のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（PEGMEMA）モノマー、長期のマイクロパターン安定性、非有する表面を生成するPEGブラシを汚れ。さらに、これらの<html>さらに、多様な化学的部分11を提示するように改変されることが可能である。 この性質を利用して、沙ら。ら 。直交「クリック」化学を提示する多成分PEGMEMAブラシで培養基板を設計する方法を開発した。この方法では、それらは、複数の固定化リガンド6のマイクロパターンを提示する培養基材を作成するために、順次、アジ化ナトリウム、エタノールアミン、プロパルギルアミンと求核置換を散在μCP/ SI-ATRPの一連のステップを使用。新規な培養基質を設計する手動μCPと一緒にそのような化学物質を使用する可能性は計り知れないが、これは、複数のμCPステップが単一の基板上に整列することが可能な精度と正確さによって制限される。精度と高精度、再現これらの多用途の技術を用いてインビトロニッチ複合体を製造するために必要とされるであろう。 この制限に対処するためにe_content &quot;&gt;は、いくつかの自動化および半自動μCPシステムが生成されている。チャクラらカスタムスタンプはレールシステム上に配置し、使用して金被覆したスライドと等角接触させるμCPシステムを開発コンピュータ制御の空気圧アクチュエータが、この方法は、カスタムスタンプ設計の正確な製造を必要とし、複数のμCP12ステップの実行時 ​​に達成精度のnoレポートを10μmの精度を報告している。最近では、統合されたキネマティックカップリングシステムを利用する方法単一のパターンを使用して、1μm未満の精度を報告したが、正確に13を成形するための金型からのスタンプの特徴の正確な制御の欠如に起因する複数のパターンを位置合わせすることができなかった。また、従来の方法の両方は、基板は、パターン形成工程の間に固定されたままにする必要が、大幅であることができる表面改質の化学的性質の多様性を制限する利用した。切手のデザインと製造における最大の柔軟性を可能にしながらここでは、複数のμCPステップの正確かつ精密な位置合わせが可能な自動化されたR-μCPシステムについて説明します。さらに、パターニングされた基板を繰り返し、それによって連続的な求核置換を含む、多様な基質修飾化学薬品の使用を可能にする、プレス加工の間にシステムから除去することができる。基板は、化学反応を用いて操作達6,14等7の両方によって以前に細胞培養のために使用されている。したがって、我々は、複雑でマイクロパターン生化学的手がかりと培養基質の製造のためのスケーラブルな方法を開発するR-μCP逐次求核置換反応をマージした。

<table><tbody><tr><td>SCARA&amp;nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Higher end models with increased precision are available if desired.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Requries specialized training.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&amp;mu;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requires rubber stoppers with diaphram.</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td></tr><tr><td>Methanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Copper(II) Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>2,2&#039;-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BSA) are available and serve this purpose.</td></tr><tr><td>12-Well Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td></tr></tbody></table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

「クリック」化学反応で官能化された直交PEGグラフト化ブラシのアレイと培養基質を設計するための手動アライメントμCP技術の使用は、以前の研究6で実証されている。しかし、これは、パターンの向きの最小の制御を提供し、多くの場合、官能化された領域の重複が生じる。ここでは、小説のR-μCPシステムは、この制限を克服するために使用され、その能力を正確にパターンを300μ...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K ビュー.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

ビデオ: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- µCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

生物工学

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a stable interface that permits efficient electron transport and protects underlying substrates from oxidative degradation. Group IV semiconductors can be effectively protected with highly-ordered self-assembled monolayers (SAMs) composed of simple alkyl chains that act as impervious barriers to both organic and aqueous solutions. Simple alkyl SAMs, however, are inert and not amenable to traditional patterning techniques. The motivation for immobilizing organic molecular systems on semiconductors is to impart new functionality to the surface that can provide optical, electronic, and mechanical function, as well as chemical and biological activity. 
Microcontact printing (&mu;CP) is a soft-lithographic technique for patterning SAMs on myriad surfaces.1-9 Despite its simplicity and versatility, the approach has been largely limited to noble metal surfaces and has not been well developed for pattern transfer to technologically important substrates such as oxide-free silicon and germanium. Furthermore, because this technique relies on the ink diffusion to transfer pattern from the elastomer to substrate, the resolution of such traditional printing is essentially limited to near 1 &mu;m.10-16
In contrast to traditional printing, inkless &mu;CP patterning relies on a specific reaction between a surface-immobilized substrate and a stamp-bound catalyst. Because the technique does not rely on diffusive SAM formation, it significantly expands the diversity of patternable surfaces. In addition, the inkless technique obviates the feature size limitations imposed by molecular diffusion, facilitating replication of very small (&lt;200 nm) features.17-23 However, up till now, inkless &mu;CP has been mainly used for patterning relatively disordered molecular systems, which do not protect underlying surfaces from degradation.
Here, we report a simple, reliable high-throughput method for patterning passivated silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate selective functionalization of the patterned substrates with both small molecules and proteins. The technique utilizes a preformed NHS-reactive bilayered system on oxide-free silicon and germanium. The NHS moiety is hydrolyzed in a pattern-specific manner with a sulfonic acid-modified acrylate stamp to produce chemically distinct patterns of NHS-activated and free carboxylic acids. A significant limitation to the resolution of many &mu;CP techniques is the use of PDMS material which lacks the mechanical rigidity necessary for high fidelity transfer. To alleviate this limitation we utilized a polyurethane acrylate polymer, a relatively rigid material that can be easily functionalized with different organic moieties. Our patterning approach completely protects both silicon and germanium from chemical oxidation, provides precise control over the shape and size of the patterned features, and gives ready access to chemically discriminated patterns that can be further functionalized with both organic and biological molecules. The approach is general and applicable to other technologically-relevant surfaces.

Here we describe a simple method for patterning oxide-free silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate functionalization of the patterned substrates with small molecules and proteins. The approach completely protects surfaces from chemical oxidation, provides precise control over feature morphology, and provides ready access to chemically discriminated patterns.

ソフトリソグラフィ機能化およびパターニング酸化物フリーシリコンとゲルマニウム

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

生物学

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

軟リソグラフィの改変を用いた根表面微細構造の生物模倣複製

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

マイクロスケール神経細胞培養デバイスへの3Dプリンティングの応用

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

著者スポットライト:脳機能解析のためのモジュール式ニューロンネットワーク

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.

2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

要約

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タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

ソフトリソグラフィ機能化およびパターニング酸化物フリーシリコンとゲルマニウム

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

軟リソグラフィの改変を用いた根表面微細構造の生物模倣複製

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

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タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

ソフトリソグラフィ機能化およびパターニング酸化物フリーシリコンとゲルマニウム

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

軟リソグラフィの改変を用いた根表面微細構造の生物模倣複製

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化