Name: fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-µcp) and sequential nucleophilic substitution
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. 생성 탄성 스탬프 <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS 스탬프의 실리콘 마스터를 생성하기 위해, 컴퓨터 이용 설계 소프트웨어를 사용하여 포토 마스크 피쳐의 패턴을 설계한다. <ol><li> 300 μm의 내경 (ID) 및 1200 μm의 중심 간 간격 600 μm의 OD를 가진 환형의 20 × 20 ​​배열로 제 1 패턴을 디자인. </li><li> 600 μm의 ID와 1,200 μm의 중심 간 간격 900 μm의 외경과 환형의 20 × 20 ​​배열로 두 번째 패턴을 디자인합니다. </li><li> 또한, 45 ° 각도에서 1,200 μm의 중심 간 코너 패턴 이격 각 배열 디자인의 네 모서리에 1 × 1mm 2 광장 참조 마크를 배치합니다. </li><li> 마이크로 유체 파운드리 다른 15 협력 상세한 표준 리소그래피 기술을 사용하여 300 ㎛의 피처 깊이 상관, 종횡비 1 : 1이 실험에서 사용하기위한 실리콘 마스터를 제조. 참고 : 기능보다 낮은 100 μm의 기판 표면과 접촉하기 전에 우표의 이상 변형으로 이어질 수 오쿠. 참고 :이 프로토콜은 전문 장비 및 만들 수있는 클린 룸을 필요로 포토 레지스트의 설명 패턴, 이미 얻은 실리콘 마스터를 가지고 시작한다. 그것은 이러한 패턴 마스터를 제작하는 제작 업체 또는 핵심 시설에 문의하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol></li><li> silanization합니다 실리콘 마스터 (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydroocty) 트리클로로 실란 증기와 배양 O / N. 참고 : 실란 증기는 매우 독성이 단지 화학 흄 후드에서 처리되어야합니다. </li><li> PDMS 사전 폴리머와 60 ° C에서 배양 접시의 O / N에 실릴 화 한 실리콘 마스터의 상단에 경화제 PDMS의 10 : 1 비율을 경화하여 실리콘 마스터의 역 복제본을 생성합니다. </li><li> 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌에 스탬프 (ABS) 백킹 또는 기타 단단한 재료를 접합접착제를 사용하여이야. 참고 : 선택의 재료는 투명 또는 생체 적합성이 될 필요는 없다. 그러나, PDMS보다 로봇 공구 및 높은 강성 인터페이스에 평평한 표면을 제공해야합니다. </li></ol> 2. 준비 Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> 린스 현미경 coverslides (24mm X 50mm # 1) 온화한 질소 기류하에 에탄올 및 건조 린스하기 전에 1 분 동안 아세톤, 톨루엔, 메탄올 및 초음파 처리한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 톨루엔과 아세톤을 처리합니다. </li><li> 집속 전자 빔 증발기를 사용하여 18.0 nm의 금 (Au) 이어 ~ 3.5 nm의 티탄 (Ti)과 코트 coverslides. 참고 :이 절차는 실리콘과 폴리스티렌을 포함하여 금 코팅 된 기판의 다양한 호환됩니다. 그것은 이러한 현장 생성하는 것이 가능하지만, 금 - 코팅 된 기판들은 상업적 공급자를 통해 가능하다. NOTE는 : 기판 상에 금 층이어야 반면에 Ti 층은 적어도 3 nm 두께이어야t 적어도 5 nm 두께 및 최종 기판 (16, 17)의 최적의 광학적 특성에 따라 두께 1mm 모든 방법의 범위 일 수있다. 기판은 제조를위한 광학적으로 투명 할 필요는 없습니다; 그러나, 제조 된 기판의 현미경 분석을 용이하게한다. </li><li> 사용 직전에 부드러운 질소 하에서 에탄올 건조 골드 코팅 coverslides을 씻어. </li></ol> 3. R​​-μCP 외부 고리의 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 선택적 호환 관절 로봇 아암 (SCARA) 시스템과 R-μCP 전에, 시스템의 소프트웨어를 이용하여 로봇 공구 이펙터 및 첨부 된 듀얼 카메라 시스템을 교정. 참고 :이 구현은 그림 1과 그림된다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> 그림 1. R- μCP 시스템 및 로봇 팔 공구. </strong&gt; (A) 모든 공구 및 비품 R-μCP 시스템의 대규모보기, (A) 진공 척, (B) 시약 목욕, (C) 하향 카메라, (D) 스탬프 중첩기구, (E) 로봇 도구입니다. (B) 로봇 팔 공구 묘사 (F) 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구 (g) 공기 흡입 도구 (H) ABS-백업 PDMS 스탬프를 들고. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 수동으로 600 μm의 ID와 900 μm의 외경이 환형가 스탬프 중첩기구에서 아래로 향하게 튀어 PDMS 스탬프를 배치합니다. 수동으로도 1a에 표시된 진공 척, 상단에 갓 청소 금 코팅 coverslide을 배치하고, 접속 실험실 진공을 이용하여 그것을 고정시킨다. </li><li> 로봇 제어를 이용하여,도 2a에서와 같이, 금 코팅 coverslide의 중심점을 통해 하향 카메라를 정렬. 참고 :이 점은 처음 육안 검사로 정의 할 수 있으며 큰 정밀도를 필요로하지 않는, PDMS 스탬프가 많은 larg의 그대로금 코팅 된 슬라이드보다 어. </li><li> 네 개의 기준을 에칭하는 로보트 팔 지시 &quot;X&quot;치수 정사각형의 정점에 마크 로봇 아암에 부착 된 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구를 사용하여 금 - 코팅 coverslide 중심 3.8 mm 3.8 mm. (그림 2B에 묘사 된, 자동화 된 프로세스) 참고 :이 네 가지 기준 마크가 하향 카메라 중 하나 시각적 프레임 내에 보장합니다. </li><li> 로봇에게 공기 흡입 도구를 사용하여, 픽 업 및 PDMS 그림 2C와 같이 스탬프 중첩기구 위의 1mm 도장을 찍어 누르고 있습니다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 스탬프의 사각형 부호를 시각화하고 스탬프의 평균 X, Y를 결정하기 위해 카메라 소프트웨어 10 배 그들을 식별하고 각도는 중심으로부터 오프셋,도 2D 및 E에서 나온 상향 대면 카메라 및 LED 조명 링을 사용하여 로봇 공구 축. (자동화 된 프로세스) </li><li> 에서와 같이 <strong&gt;도 2a는, 시각화하고 로봇 툴링 축 중심으로부터 오프셋 coverslide의 평균 X, Y 센터 위치 및 각도를 결정하는 coverslide의 에칭 부호 10 번 검출 하향 카메라를 사용한다. (자동화 된 프로세스). 참고 : 내부 계산이 정확하게 정렬하는 로봇 시스템의 소프트웨어에 의해 수행되는 스탬프의 미래 R-μCP 단계에 커버 슬립의 X, Y 센터의 위치와 각도 오프셋 (offset). </li><li> 그림 2 층에 도시 된 바와 같이 3.8)) 알칸 ATRP 개시제, ω-mercaptoundecyl의 모이 소 부티레이트 (에탄올에 2 mm의 목욕 스탬프를 놓습니다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 알칸 티올 솔루션에서 스탬프를 제거하고 그림 2G와 같이 에탄올을 증발 0.48 바 (5 PSI)에 가압 질소 스트림을 통해 놓습니다. 1 분 후, 질소 기류의 압력이 균일 한 건조를 보장하기 위해 1.03 바 (15 PSI)이다 증가. (자동화 된 프로세스) 참고 : 불완전한 건조 패턴 충실도의 전체 또는 일부가 손실 될 수 있습니다. </li><li> 건조 후, 금 - 코팅 슬라이드의 계산 된 중심 위치 위에 스탬프를 이동 및도 2H에 도시 된 바와 같이, Z 축 모터 력을 모니터링하면서 100 ㎛ 단위로 값을 낮추. NOTE : 이것은 Z 축 모터에 의해 경험 및 로봇 가이던스 소프트웨어에 표시된 토크로 전달된다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 79.2 인민군 소정의 압력이 달성 된 후에는 스탬프를 낮추는 중지하고 15 초 동안 금 코팅 된 슬라이드와 접촉을 유지한다. (자동화 된 프로세스) 참고 : 압력 값이 여기에 현재 스탬프 디자인과 기능을 높이 최적화되어 있습니다. 스탬프 디자인은 시행 착오 공정에 의해 이러한 구체적 따라 높은 종횡비의 우표, 튜닝을 위해, 변경된 경우. </li><li> 천천히 금 코팅 된 슬라이드에서 스탬프를 제거하고 다시 스탬프 중첩기구에서 스탬프를 배치합니다. (자동화 된 프로세스) </li></OL&gt; 미세 패턴 Coverslides에 PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 진공 압력 미세 패턴 coverslide를 들고 해제하고, 50 ml의 쉬 렝크 플라스크에 옮긴다. 인감 및 가스를 제거 쉬 렌크는 진공 펌프를 사용하여 플라스크. </li><li> 추가로 거대 PEGMEMA (208.75 밀리몰), 물 (34.4 ㎖), 메탄올 (43.8 ㎖), 구리 (II) 브로마이드 (1 밀리몰), 및 2 &#39;, 2- 피리딘 (3 밀리몰)을 함유하는 ATRP 반응 혼합물을 5.5 ml의 쉬 렝크 플라스크. </li><li> 반응을 개시 물에 L - 아스 코르 빈산 나트륨 (454.3 mM)을 0.5 mL를 넣고는 불활성 가스 하에서 실온에서 16 시간 동안 계속 할 수 있습니다. NOTE :도 3A-B에 도시 된 바와 같이, L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음은, 반응 색이 짙은 갈색 빛 녹색에서 이동한다. 주 : 반응은 16 시간 이상을 계속할 수 있지만, 상당히 PEG 브러시의 길이를 증가하지 않을 것이다. </li></ol><imgALT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot;/&gt; SI-ATRP 그림 3. 개시. (A) 반응 및 L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음에 (B) 이후의 색상 변화의 개시. SI-ATRP 절차에 따라 미세 패턴 coverslide 표면의 (C) 현미경 이미지. 스케일 바 1mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> 쉥크 플라스크에서 미세 패턴 coverslide를 제거하고 부드러운 질소 기류 하에서 에탄올, 물, 에탄올 건조 씻어. NOTE : SI-ATRP 다음은, 표면 수정은 눈으로 볼 수 있어야 및도 3c에서와 같이 현미경으로 촬상하고 분석 할 수있다. NOTE : 이것은 기판을 발현 사이 할 필요성을 제거 같이 시험의 정밀도를 테스트하는 간단한 방법이다. </li></ol> 미세 패턴 PEGMEMA 체인 5. 아 지드 화 기능화 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> N 6 mL를 넣어 반응 바이알을 100 mM의 나트륨 아 지드를 함유하는 N 디메틸 포름 아미드 (DMF). 24 시간 동안 37 ° C에서 반응을 유지한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMF를 처리합니다. 아 지드 화 나트륨을 계량 할 때주의하십시오. </li><li> 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 브롬 기능화 PEGMEMA 체인의 6 패시베이션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 마이크로 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> 100 mM의 에탄올 아민과 반응 바이알에 300 mM의 트리 에틸 아민을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (DMSO)의 6 ml의 추가. 24 시간 동안 40 ° C에서 반응을 잡습니다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO, 에탄올 아민, 트리 에틸 아민을 처리합니다. </li><li> 완료되면 미세 패턴 coversl를 제거반응 바이알에서 IDE는, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 내부 고리 7. R-μCP과 PEGMEMA의 SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 작은 기능 환형가 이전에 마이크로 패턴 환형 내부에 배치되도록 300 μm의 ID 및 600 μm의 OD 돌출 된 환형와 PDMS 스탬프를 대체, 3.12 - 이전 단계 3.2 및 3.6에 설명 된대로 R-μCP 단계를 수행하십시오. 참고 :이 우표에 대한 압력을 임계 값이 132.0 kPa의입니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 이러한 압력 설정은 스탬프 기능이 실험에서 사용되는 최적화되어있다. </li><li> 4.4 - 이전 단계 4.1에 기재된 바와 같이 SI-ATRP 단계를 수행. </li></ol> 미세 패턴 PEGMEMA 체인 8. 아세틸렌 기능화 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> DMSO는 mM의 (100)를 포함하는 6 ML을 추가반응 바이알에 propargylamine. 24 시간 동안 실온에서 반응을 유지한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO와 propargylamine을 처리합니다. </li><li> 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 9. 구리 촉매 &quot;를 클릭&quot;아세틸렌의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> 구리 설페이트 (15 mM)을 / 트리스 [(1- 벤질 -1- H -1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA, 30 mM)을 6 ㎖ (추가 1 : 1 V / V, 물 반응 바이알에 562 μM 지드 -4- -Biotin-PEG 접합체를 함유 / DMF). 반응을 초기화하기 위해 상기 혼합물에 물 L 아스코르브 산 (0.15 mM)을 1.2 ml의 추가. </li><li> 10 초 동안 반응 용액을 통해 버블 질소, 파라 필름을 유리 병을 밀봉하고, 실온에서 24 시간 동안 반응. </li><li> completio시N, 반응 유리 병에서 미세 패턴 coverslide을 제거 물로 씻어 내고 12 웰 폴리스티렌 접시에 놓습니다. </li></ol> 바이오틴이 아세틸렌 그룹 10. 면역 형광 검출 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 실온에서 1 시간 동안 DPBS (3 % 당나귀 혈청)의 미세 패턴 coverslide을 차단합니다. 실온에서 2 시간 동안 admin으로의 스트렙 타비 딘 - 546 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (PBS에서 3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아세틸렌 그룹의 얼룩. </li><li> 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS 5 번 씻어. 주 :이 단계가 완료된 후도 4b는 슬라이드의 이미지를 나타낸다. </li></ol> 11. 구리 무 &quot;를 클릭&quot;아 지드의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료 주 : 필요한 경우,이 기판 개질 공정은 세포 배양액 중에 반응계에서 수행 될 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12 웰 P에 미세 패턴 coverslide를 남겨olystyrene 요리 다음 admin으로는 빨고. </li><li> 20 μM DBCO-PEG 4 -Biotin를 포함, admin으로 (또는 세포 배양 배지) 2 mL를 넣고 반응을 실온에서 24 시간 동안 계속 할 수 있도록 (또는 인큐베이터에서 37 ° C에서). </li><li> DPBS이 (또는 단순히 미디어 변경을 수행)를 완료하면, 미세 패턴 coverslide 5 번 헹군다. </li></ol> 바이오틴이 아 지드 그룹 (12) 면역 형광 검출 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 실온에서 2 시간 동안 2 ML의 DPBS에 스트렙 타비 딘-488 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아 지드 그룹의 얼룩. </li><li> 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS에 5 번 씻어. </li><li> 이미지 공 초점 형광 현미경을 이용하여 미세 패턴 coverslide.이 단계가 완료된 후도 4A-C는 슬라이드의 이미지를 도시한다. NOTE : 조직 배양 분석 용 기판을 사용하는 경우, 섹션 (10) 및이 프로토콜 (12)을 이동. 원하는 degre 후작용 화의 예는, 질소 기류하에 100 % 에탄올 및 건조 양측 세정하여 설계 coverslide 살균. 멸균 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 전송하고 세포 파종과 문화를 진행하기 전에 PBS로 5 회를 슬라이드를 씻어. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정?...

동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 - 직교 &quot;클릭&quot;화학 그들이 천연 배좌 4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다. 생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, 단백질의 물리적 흡착을 제한합니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 SAM을 장기 세포 배양 배지에서 산화에 민감하다. 따라서, SAM에 알칸 티올 μCP&#39;d은 종종 더 지역의 비 오염 안정성 (10)을 높이기 위해 표면 시작한 원자 이동 라디칼 중합 (SI-ATRP)을 사용하여 PEG 폴리머 브러시로 이식된다. 구체적 μCP는 알칸 티올 중합 개시제, 폴리 SI-ATRP (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타 크릴 레이트 (PEGMEMA) 모노머 이어 금 - 코팅 된 표면에 ω-meraptoundecyl의 모이 소 부티레이트은, 미세 패턴 장기간, 안정적이며 비와 표면을 생성 오염 PEG 브러쉬. 또한,이<html> 상기 다양한 화학 잔기 (11)를 제시하도록 변형 될 수있다. 이 속성, 샤 등을 활용. 알. 직교 &quot;클릭&quot;화학을 제시 성분 PEGMEMA 브러쉬와 문화 기판을 설계하는 방법을 개발했다. 이 방법에서는, 그들은 순차적 아 지드 화 나트륨, 에탄올 산재 μCP / SI-ATRP 일련의 단계를 사용하여, 복수 고정화 리간드 (6)의 마이크로 패턴을 제시 배양 기질을 만드는 핵성 치환을 propargylamine. 신규 배양 기판을 설계 할 μCP 설명서와 함께 이러한 화학 제를 사용하는 가능성이 엄청난이지만, 여러 μCP 단계들이 단일 기판 상에 정렬 될 수있는 정밀도 및 정확도에 의해 제한된다. 정밀도와 정확도가 높은 재현성이 다용도 기법을 이용하여 시험 관내에서 틈새 착체를 제조하는 것이 필요할 것이다. e_content가 &quot;&gt; 이러한 한계를 해결하기 위해, 여러 자동 및 반자동 μCP 시스템 알.. 차크라 등. 생성 된 사용자 정의 스탬프 레일 시스템 상에 배치하여 금 - 코팅 슬라이드와 등각 접촉되는 μCP 시스템이 개발되어왔다 컴퓨터로 제어되는 공기압 액츄에이터. 그러나,이 방법은 정의 스탬프 디자인의 정밀한 제작이 필요하며 다수 μCP 12 단계를 수행 할 때 실현 : 정확도 보고서 10 μm의 정밀도를보고한다. 최근에는 집적 키네마 틱 커플 링 시스템을 이용하는 방법을 보고 하나의 패턴을 사용하여 1 ㎛ 이하의 정밀도,하지만 인해 (13)을 성형하는 금형 스탬프 기능을 정밀하게 제어의 부족으로 정확히 여러 패턴을 정렬 할 수 없습니다. 또한, 이전의 방법 모두 패터닝 단계 사이에 고정 된 상태로 유지하기 위해 기판을 필요로 함으로써 크게 될 수 표면 개질 화학의 다양성을 제한이용했다. 스탬프 디자인과 제조에있어서 최대의 유연성을 허용하면서 여기서는 μCP 여러 단계의 정확하고 정밀한 정렬 자동화 R-μCP 시스템이 할 설명한다. 또한, 패터닝 된 기판을 반복하여 순차 핵성 치환을 포함한 다양한 기판 변형 화학의 사용을 허용하는, 스탬핑 사이의 시스템으로부터 제거 될 수있다. 이러한 화학 물질을 사용하여 설계 기판은 우리 모두 6,14 등 7 이전에 세포 배양에 사용되어왔다. 따라서, 우리는 복잡하고 미세 패턴 생화학 단서와 함께 배양 기판의 확장 제조 방법을 개발하기 위해 R-μCP 순차적 친 핵성 치환 반응을 병합 하였다.

<table><tbody><tr><td>SCARA&amp;nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Higher end models with increased precision are available if desired.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Requries specialized training.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&amp;mu;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requires rubber stoppers with diaphram.</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td></tr><tr><td>Methanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Copper(II) Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>2,2&#039;-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BSA) are available and serve this purpose.</td></tr><tr><td>12-Well Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td></tr></tbody></table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

수동 정렬 μCP 기술의 사용은 수직으로 작용 PEG-이식 브러쉬의 배열과 문화 기판을 설계하는 화학은 이전의 연구 (6)에서 증명되었다 &quot;클릭&quot;. 그러나,이 패턴 방향의 최소한의 제어를 제공하고 종종 관능 화 영역의 중첩을 초래한다. 여기서, 신규 한 R-μCP 시스템은 이러한 한계를 극복하기 위해 사용하고, 그 능력을 정확하게 패턴을 300㎛ ID 및 600 μm의의 OD 600 ㎛의과 PEG 브러시 환상 ...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K 조회수.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

생물학

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치를 위한 3D 프린팅의 응용

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

저자 스포트라이트: 뇌 기능 분석을 위한 모듈식 뉴런 네트워크

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...