Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. 생성 탄성 스탬프 <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS 스탬프의 실리콘 마스터를 생성하기 위해, 컴퓨터 이용 설계 소프트웨어를 사용하여 포토 마스크 피쳐의 패턴을 설계한다. <ol><li> 300 μm의 내경 (ID) 및 1200 μm의 중심 간 간격 600 μm의 OD를 가진 환형의 20 × 20 ​​배열로 제 1 패턴을 디자인. </li><li> 600 μm의 ID와 1,200 μm의 중심 간 간격 900 μm의 외경과 환형의 20 × 20 ​​배열로 두 번째 패턴을 디자인합니다. </li><li> 또한, 45 ° 각도에서 1,200 μm의 중심 간 코너 패턴 이격 각 배열 디자인의 네 모서리에 1 × 1mm 2 광장 참조 마크를 배치합니다. </li><li> 마이크로 유체 파운드리 다른 15 협력 상세한 표준 리소그래피 기술을 사용하여 300 ㎛의 피처 깊이 상관, 종횡비 1 : 1이 실험에서 사용하기위한 실리콘 마스터를 제조. 참고 : 기능보다 낮은 100 μm의 기판 표면과 접촉하기 전에 우표의 이상 변형으로 이어질 수 오쿠. 참고 :이 프로토콜은 전문 장비 및 만들 수있는 클린 룸을 필요로 포토 레지스트의 설명 패턴, 이미 얻은 실리콘 마스터를 가지고 시작한다. 그것은 이러한 패턴 마스터를 제작하는 제작 업체 또는 핵심 시설에 문의하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol></li><li> silanization합니다 실리콘 마스터 (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydroocty) 트리클로로 실란 증기와 배양 O / N. 참고 : 실란 증기는 매우 독성이 단지 화학 흄 후드에서 처리되어야합니다. </li><li> PDMS 사전 폴리머와 60 ° C에서 배양 접시의 O / N에 실릴 화 한 실리콘 마스터의 상단에 경화제 PDMS의 10 : 1 비율을 경화하여 실리콘 마스터의 역 복제본을 생성합니다. </li><li> 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌에 스탬프 (ABS) 백킹 또는 기타 단단한 재료를 접합접착제를 사용하여이야. 참고 : 선택의 재료는 투명 또는 생체 적합성이 될 필요는 없다. 그러나, PDMS보다 로봇 공구 및 높은 강성 인터페이스에 평평한 표면을 제공해야합니다. </li></ol> 2. 준비 Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> 린스 현미경 coverslides (24mm X 50mm # 1) 온화한 질소 기류하에 에탄올 및 건조 린스하기 전에 1 분 동안 아세톤, 톨루엔, 메탄올 및 초음파 처리한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 톨루엔과 아세톤을 처리합니다. </li><li> 집속 전자 빔 증발기를 사용하여 18.0 nm의 금 (Au) 이어 ~ 3.5 nm의 티탄 (Ti)과 코트 coverslides. 참고 :이 절차는 실리콘과 폴리스티렌을 포함하여 금 코팅 된 기판의 다양한 호환됩니다. 그것은 이러한 현장 생성하는 것이 가능하지만, 금 - 코팅 된 기판들은 상업적 공급자를 통해 가능하다. NOTE는 : 기판 상에 금 층이어야 반면에 Ti 층은 적어도 3 nm 두께이어야t 적어도 5 nm 두께 및 최종 기판 (16, 17)의 최적의 광학적 특성에 따라 두께 1mm 모든 방법의 범위 일 수있다. 기판은 제조를위한 광학적으로 투명 할 필요는 없습니다; 그러나, 제조 된 기판의 현미경 분석을 용이하게한다. </li><li> 사용 직전에 부드러운 질소 하에서 에탄올 건조 골드 코팅 coverslides을 씻어. </li></ol> 3. R​​-μCP 외부 고리의 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 선택적 호환 관절 로봇 아암 (SCARA) 시스템과 R-μCP 전에, 시스템의 소프트웨어를 이용하여 로봇 공구 이펙터 및 첨부 된 듀얼 카메라 시스템을 교정. 참고 :이 구현은 그림 1과 그림된다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> 그림 1. R- μCP 시스템 및 로봇 팔 공구. </strong&gt; (A) 모든 공구 및 비품 R-μCP 시스템의 대규모보기, (A) 진공 척, (B) 시약 목욕, (C) 하향 카메라, (D) 스탬프 중첩기구, (E) 로봇 도구입니다. (B) 로봇 팔 공구 묘사 (F) 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구 (g) 공기 흡입 도구 (H) ABS-백업 PDMS 스탬프를 들고. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 수동으로 600 μm의 ID와 900 μm의 외경이 환형가 스탬프 중첩기구에서 아래로 향하게 튀어 PDMS 스탬프를 배치합니다. 수동으로도 1a에 표시된 진공 척, 상단에 갓 청소 금 코팅 coverslide을 배치하고, 접속 실험실 진공을 이용하여 그것을 고정시킨다. </li><li> 로봇 제어를 이용하여,도 2a에서와 같이, 금 코팅 coverslide의 중심점을 통해 하향 카메라를 정렬. 참고 :이 점은 처음 육안 검사로 정의 할 수 있으며 큰 정밀도를 필요로하지 않는, PDMS 스탬프가 많은 larg의 그대로금 코팅 된 슬라이드보다 어. </li><li> 네 개의 기준을 에칭하는 로보트 팔 지시 &quot;X&quot;치수 정사각형의 정점에 마크 로봇 아암에 부착 된 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구를 사용하여 금 - 코팅 coverslide 중심 3.8 mm 3.8 mm. (그림 2B에 묘사 된, 자동화 된 프로세스) 참고 :이 네 가지 기준 마크가 하향 카메라 중 하나 시각적 프레임 내에 보장합니다. </li><li> 로봇에게 공기 흡입 도구를 사용하여, 픽 업 및 PDMS 그림 2C와 같이 스탬프 중첩기구 위의 1mm 도장을 찍어 누르고 있습니다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 스탬프의 사각형 부호를 시각화하고 스탬프의 평균 X, Y를 결정하기 위해 카메라 소프트웨어 10 배 그들을 식별하고 각도는 중심으로부터 오프셋,도 2D 및 E에서 나온 상향 대면 카메라 및 LED 조명 링을 사용하여 로봇 공구 축. (자동화 된 프로세스) </li><li> 에서와 같이 <strong&gt;도 2a는, 시각화하고 로봇 툴링 축 중심으로부터 오프셋 coverslide의 평균 X, Y 센터 위치 및 각도를 결정하는 coverslide의 에칭 부호 10 번 검출 하향 카메라를 사용한다. (자동화 된 프로세스). 참고 : 내부 계산이 정확하게 정렬하는 로봇 시스템의 소프트웨어에 의해 수행되는 스탬프의 미래 R-μCP 단계에 커버 슬립의 X, Y 센터의 위치와 각도 오프셋 (offset). </li><li> 그림 2 층에 도시 된 바와 같이 3.8)) 알칸 ATRP 개시제, ω-mercaptoundecyl의 모이 소 부티레이트 (에탄올에 2 mm의 목욕 스탬프를 놓습니다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 알칸 티올 솔루션에서 스탬프를 제거하고 그림 2G와 같이 에탄올을 증발 0.48 바 (5 PSI)에 가압 질소 스트림을 통해 놓습니다. 1 분 후, 질소 기류의 압력이 균일 한 건조를 보장하기 위해 1.03 바 (15 PSI)이다 증가. (자동화 된 프로세스) 참고 : 불완전한 건조 패턴 충실도의 전체 또는 일부가 손실 될 수 있습니다. </li><li> 건조 후, 금 - 코팅 슬라이드의 계산 된 중심 위치 위에 스탬프를 이동 및도 2H에 도시 된 바와 같이, Z 축 모터 력을 모니터링하면서 100 ㎛ 단위로 값을 낮추. NOTE : 이것은 Z 축 모터에 의해 경험 및 로봇 가이던스 소프트웨어에 표시된 토크로 전달된다. (자동화 된 프로세스) </li><li> 79.2 인민군 소정의 압력이 달성 된 후에는 스탬프를 낮추는 중지하고 15 초 동안 금 코팅 된 슬라이드와 접촉을 유지한다. (자동화 된 프로세스) 참고 : 압력 값이 여기에 현재 스탬프 디자인과 기능을 높이 최적화되어 있습니다. 스탬프 디자인은 시행 착오 공정에 의해 이러한 구체적 따라 높은 종횡비의 우표, 튜닝을 위해, 변경된 경우. </li><li> 천천히 금 코팅 된 슬라이드에서 스탬프를 제거하고 다시 스탬프 중첩기구에서 스탬프를 배치합니다. (자동화 된 프로세스) </li></OL&gt; 미세 패턴 Coverslides에 PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 진공 압력 미세 패턴 coverslide를 들고 해제하고, 50 ml의 쉬 렝크 플라스크에 옮긴다. 인감 및 가스를 제거 쉬 렌크는 진공 펌프를 사용하여 플라스크. </li><li> 추가로 거대 PEGMEMA (208.75 밀리몰), 물 (34.4 ㎖), 메탄올 (43.8 ㎖), 구리 (II) 브로마이드 (1 밀리몰), 및 2 &#39;, 2- 피리딘 (3 밀리몰)을 함유하는 ATRP 반응 혼합물을 5.5 ml의 쉬 렝크 플라스크. </li><li> 반응을 개시 물에 L - 아스 코르 빈산 나트륨 (454.3 mM)을 0.5 mL를 넣고는 불활성 가스 하에서 실온에서 16 시간 동안 계속 할 수 있습니다. NOTE :도 3A-B에 도시 된 바와 같이, L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음은, 반응 색이 짙은 갈색 빛 녹색에서 이동한다. 주 : 반응은 16 시간 이상을 계속할 수 있지만, 상당히 PEG 브러시의 길이를 증가하지 않을 것이다. </li></ol><imgALT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot;/&gt; SI-ATRP 그림 3. 개시. (A) 반응 및 L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음에 (B) 이후의 색상 변화의 개시. SI-ATRP 절차에 따라 미세 패턴 coverslide 표면의 (C) 현미경 이미지. 스케일 바 1mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> 쉥크 플라스크에서 미세 패턴 coverslide를 제거하고 부드러운 질소 기류 하에서 에탄올, 물, 에탄올 건조 씻어. NOTE : SI-ATRP 다음은, 표면 수정은 눈으로 볼 수 있어야 및도 3c에서와 같이 현미경으로 촬상하고 분석 할 수있다. NOTE : 이것은 기판을 발현 사이 할 필요성을 제거 같이 시험의 정밀도를 테스트하는 간단한 방법이다. </li></ol> 미세 패턴 PEGMEMA 체인 5. 아 지드 화 기능화 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> N 6 mL를 넣어 반응 바이알을 100 mM의 나트륨 아 지드를 함유하는 N 디메틸 포름 아미드 (DMF). 24 시간 동안 37 ° C에서 반응을 유지한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMF를 처리합니다. 아 지드 화 나트륨을 계량 할 때주의하십시오. </li><li> 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 브롬 기능화 PEGMEMA 체인의 6 패시베이션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 마이크로 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> 100 mM의 에탄올 아민과 반응 바이알에 300 mM의 트리 에틸 아민을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (DMSO)의 6 ml의 추가. 24 시간 동안 40 ° C에서 반응을 잡습니다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO, 에탄올 아민, 트리 에틸 아민을 처리합니다. </li><li> 완료되면 미세 패턴 coversl를 제거반응 바이알에서 IDE는, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 내부 고리 7. R-μCP과 PEGMEMA의 SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 작은 기능 환형가 이전에 마이크로 패턴 환형 내부에 배치되도록 300 μm의 ID 및 600 μm의 OD 돌출 된 환형와 PDMS 스탬프를 대체, 3.12 - 이전 단계 3.2 및 3.6에 설명 된대로 R-μCP 단계를 수행하십시오. 참고 :이 우표에 대한 압력을 임계 값이 132.0 kPa의입니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 이러한 압력 설정은 스탬프 기능이 실험에서 사용되는 최적화되어있다. </li><li> 4.4 - 이전 단계 4.1에 기재된 바와 같이 SI-ATRP 단계를 수행. </li></ol> 미세 패턴 PEGMEMA 체인 8. 아세틸렌 기능화 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> DMSO는 mM의 (100)를 포함하는 6 ML을 추가반응 바이알에 propargylamine. 24 시간 동안 실온에서 반응을 유지한다. 참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO와 propargylamine을 처리합니다. </li><li> 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조. </li></ol> 9. 구리 촉매 &quot;를 클릭&quot;아세틸렌의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다. </li><li> 구리 설페이트 (15 mM)을 / 트리스 [(1- 벤질 -1- H -1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA, 30 mM)을 6 ㎖ (추가 1 : 1 V / V, 물 반응 바이알에 562 μM 지드 -4- -Biotin-PEG 접합체를 함유 / DMF). 반응을 초기화하기 위해 상기 혼합물에 물 L 아스코르브 산 (0.15 mM)을 1.2 ml의 추가. </li><li> 10 초 동안 반응 용액을 통해 버블 질소, 파라 필름을 유리 병을 밀봉하고, 실온에서 24 시간 동안 반응. </li><li> completio시N, 반응 유리 병에서 미세 패턴 coverslide을 제거 물로 씻어 내고 12 웰 폴리스티렌 접시에 놓습니다. </li></ol> 바이오틴이 아세틸렌 그룹 10. 면역 형광 검출 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 실온에서 1 시간 동안 DPBS (3 % 당나귀 혈청)의 미세 패턴 coverslide을 차단합니다. 실온에서 2 시간 동안 admin으로의 스트렙 타비 딘 - 546 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (PBS에서 3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아세틸렌 그룹의 얼룩. </li><li> 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS 5 번 씻어. 주 :이 단계가 완료된 후도 4b는 슬라이드의 이미지를 나타낸다. </li></ol> 11. 구리 무 &quot;를 클릭&quot;아 지드의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료 주 : 필요한 경우,이 기판 개질 공정은 세포 배양액 중에 반응계에서 수행 될 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12 웰 P에 미세 패턴 coverslide를 남겨olystyrene 요리 다음 admin으로는 빨고. </li><li> 20 μM DBCO-PEG 4 -Biotin를 포함, admin으로 (또는 세포 배양 배지) 2 mL를 넣고 반응을 실온에서 24 시간 동안 계속 할 수 있도록 (또는 인큐베이터에서 37 ° C에서). </li><li> DPBS이 (또는 단순히 미디어 변경을 수행)를 완료하면, 미세 패턴 coverslide 5 번 헹군다. </li></ol> 바이오틴이 아 지드 그룹 (12) 면역 형광 검출 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 실온에서 2 시간 동안 2 ML의 DPBS에 스트렙 타비 딘-488 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아 지드 그룹의 얼룩. </li><li> 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS에 5 번 씻어. </li><li> 이미지 공 초점 형광 현미경을 이용하여 미세 패턴 coverslide.이 단계가 완료된 후도 4A-C는 슬라이드의 이미지를 도시한다. NOTE : 조직 배양 분석 용 기판을 사용하는 경우, 섹션 (10) 및이 프로토콜 (12)을 이동. 원하는 degre 후작용 화의 예는, 질소 기류하에 100 % 에탄올 및 건조 양측 세정하여 설계 coverslide 살균. 멸균 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 전송하고 세포 파종과 문화를 진행하기 전에 PBS로 5 회를 슬라이드를 씻어. </li></ol>

<ol>
	<li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology:+Current+Applications+and+Future+Perspectives.">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li><li>Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood.">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li><li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Pursuit+of+Zero:+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins.">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li><li>Rozkiewicz, D. I., Ja&#324;czewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click&#8221;+Chemistry+by+Microcontact+Printing.">Click&#8221; Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li><li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology.">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li><li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes.">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li><li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD&#8212;Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">RGD&#8212;Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li><li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays.">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li><li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Self-Assembled+Monolayers:+Efficient,+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology.">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li><li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li><li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Fouling&#8221;+Oligo(ethylene+glycol)-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Non-Fouling&#8221; Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li><li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment.">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li><li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling.">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).</li><li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+robotic+microcontact+printing+(R-&#956;CP)+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm.">High-precision robotic microcontact printing (R-&#956;CP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning.">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures.">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li><li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo(ethylene+glycol)+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold.">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li><li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정?...

동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 - 직교 &quot;클릭&quot;화학 그들이 천연 배좌 4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다. 생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, 단백질의 물리적 흡착을 제한합니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 SAM을 장기 세포 배양 배지에서 산화에 민감하다. 따라서, SAM에 알칸 티올 μCP&#39;d은 종종 더 지역의 비 오염 안정성 (10)을 높이기 위해 표면 시작한 원자 이동 라디칼 중합 (SI-ATRP)을 사용하여 PEG 폴리머 브러시로 이식된다. 구체적 μCP는 알칸 티올 중합 개시제, 폴리 SI-ATRP (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타 크릴 레이트 (PEGMEMA) 모노머 이어 금 - 코팅 된 표면에 ω-meraptoundecyl의 모이 소 부티레이트은, 미세 패턴 장기간, 안정적이며 비와 표면을 생성 오염 PEG 브러쉬. 또한,이<html> 상기 다양한 화학 잔기 (11)를 제시하도록 변형 될 수있다. 이 속성, 샤 등을 활용. 알. 직교 &quot;클릭&quot;화학을 제시 성분 PEGMEMA 브러쉬와 문화 기판을 설계하는 방법을 개발했다. 이 방법에서는, 그들은 순차적 아 지드 화 나트륨, 에탄올 산재 μCP / SI-ATRP 일련의 단계를 사용하여, 복수 고정화 리간드 (6)의 마이크로 패턴을 제시 배양 기질을 만드는 핵성 치환을 propargylamine. 신규 배양 기판을 설계 할 μCP 설명서와 함께 이러한 화학 제를 사용하는 가능성이 엄청난이지만, 여러 μCP 단계들이 단일 기판 상에 정렬 될 수있는 정밀도 및 정확도에 의해 제한된다. 정밀도와 정확도가 높은 재현성이 다용도 기법을 이용하여 시험 관내에서 틈새 착체를 제조하는 것이 필요할 것이다. e_content가 &quot;&gt; 이러한 한계를 해결하기 위해, 여러 자동 및 반자동 μCP 시스템 알.. 차크라 등. 생성 된 사용자 정의 스탬프 레일 시스템 상에 배치하여 금 - 코팅 슬라이드와 등각 접촉되는 μCP 시스템이 개발되어왔다 컴퓨터로 제어되는 공기압 액츄에이터. 그러나,이 방법은 정의 스탬프 디자인의 정밀한 제작이 필요하며 다수 μCP 12 단계를 수행 할 때 실현 : 정확도 보고서 10 μm의 정밀도를보고한다. 최근에는 집적 키네마 틱 커플 링 시스템을 이용하는 방법을 보고 하나의 패턴을 사용하여 1 ㎛ 이하의 정밀도,하지만 인해 (13)을 성형하는 금형 스탬프 기능을 정밀하게 제어의 부족으로 정확히 여러 패턴을 정렬 할 수 없습니다. 또한, 이전의 방법 모두 패터닝 단계 사이에 고정 된 상태로 유지하기 위해 기판을 필요로 함으로써 크게 될 수 표면 개질 화학의 다양성을 제한이용했다. 스탬프 디자인과 제조에있어서 최대의 유연성을 허용하면서 여기서는 μCP 여러 단계의 정확하고 정밀한 정렬 자동화 R-μCP 시스템이 할 설명한다. 또한, 패터닝 된 기판을 반복하여 순차 핵성 치환을 포함한 다양한 기판 변형 화학의 사용을 허용하는, 스탬핑 사이의 시스템으로부터 제거 될 수있다. 이러한 화학 물질을 사용하여 설계 기판은 우리 모두 6,14 등 7 이전에 세포 배양에 사용되어왔다. 따라서, 우리는 복잡하고 미세 패턴 생화학 단서와 함께 배양 기판의 확장 제조 방법을 개발하기 위해 R-μCP 순차적 친 핵성 치환 반응을 병합 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

수동 정렬 μCP 기술의 사용은 수직으로 작용 PEG-이식 브러쉬의 배열과 문화 기판을 설계하는 화학은 이전의 연구 (6)에서 증명되었다 &quot;클릭&quot;. 그러나,이 패턴 방향의 최소한의 제어를 제공하고 종종 관능 화 영역의 중첩을 초래한다. 여기서, 신규 한 R-μCP 시스템은 이러한 한계를 극복하기 위해 사용하고, 그 능력을 정확하게 패턴을 300㎛ ID 및 600 μm의의 OD 600 ㎛의과 PEG 브러시 환상 ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K 조회수.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

비디오: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- µCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

연구

생체공학

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 초 소수성 고분자 재료를 제조

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

면 분석 장치를 제조

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

순차적 3D-3D 등록을 이용한 4차원 CT 분석

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

로봇 미세 주입을 사용하여 뇌 조각의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...