Name: fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-µcp) and sequential nucleophilic substitution
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Yaratma Elastomerik Pullar <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri. <ol><li> 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın. </li><li> 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın. </li><li> Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm 2 kare referans işaretlerini yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan dökümhane ile başka bir yerde, 15 veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal. Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri. NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir. </li></ol></li><li> Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N. NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C&#39;de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun. </li><li> Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s. Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir. </li></ol> 2. hazırlanması Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun. </li><li> Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides. NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir. NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın 16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır. </li><li> Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın. </li></ol> 3. R-μCP dış çevresinin <ol style="margin-left: 40px;"><li> Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre. NOT: Bu aletler Şekil 1&#39;de resmedilmiştir. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. </strong&gt; (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz. </li><li> Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın. NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er. </li><li> Dört başvuru etch robot kolu talimat &quot;X&quot; boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B&#39;de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar. </li><li> Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Olduğu gibi <strong&gt; Şekil 2A, görselleştirmek ve robot takım ekseni merkezinden ofset coverslide ortalama X, Y merkezi yerleri ve açısal belirlemek için coverslide en kazınmış referans işaretlendiği 10 kez algılamak için aşağı bakan kamerayı kullanmak. (OTOMATİK SÜRECİ). NOT: Bir iç hesaplama tam hizalamak için robotik sistemin yazılımı tarafından gerçekleştirilir damga ve geleceğin R-μCP adımlarla Coverslip X, Y, merkezi yerleri ve açısal uzaklıklar. </li><li> Şekil 2F&#39;de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur. </li><li> Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H&#39;de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin. NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir. </li><li> Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ) </li></ol&gt; Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml&#39;lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi. </li><li> Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 &#39;, 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi. </li><li> Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar. NOT: Şekil 3A-B&#39;de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir. NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır. </li></ol><imgalt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; SI-ATRP Şekil 3. başlatılması. (A) reaksiyonu ve L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra (B), müteakip bir renk değişikliğiyle başlatılması. SI ATRP prosedür takip edilerek micropatterned coverslide yüzeyinin (C) mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın. Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C&#39;de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir. Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C &#39;de bu reaksiyon koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C&#39;de, bu reaksiyonu tutun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun. </li><li> Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP&#39;si <ol style="margin-left: 40px;"><li> Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın. NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir. </li><li> 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP&#39;si adımları uygulayın. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> 9. Bakır-katalize &quot;Click&quot; Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG 4 -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir. </li><li> 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer. </li><li> Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun. </li></ol> Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın. Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir. </li></ol> 11. Bakır-free &quot;Click&quot; Azide&#39;da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular. </li><li> 20 uM DBCO-PEG 4 -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de). </li><li> DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın. </li></ol> Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır. NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology:+Current+Applications+and+Future+Perspectives.">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li><li>Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood.">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li><li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Pursuit+of+Zero:+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins.">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li><li>Rozkiewicz, D. I., Ja&#324;czewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click&#8221;+Chemistry+by+Microcontact+Printing.">Click&#8221; Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li><li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology.">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li><li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes.">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li><li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD&#8212;Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">RGD&#8212;Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li><li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays.">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li><li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Self-Assembled+Monolayers:+Efficient,+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology.">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li><li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li><li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Fouling&#8221;+Oligo(ethylene+glycol)-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Non-Fouling&#8221; Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li><li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment.">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li><li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling.">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).</li><li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+robotic+microcontact+printing+(R-&#956;CP)+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm.">High-precision robotic microcontact printing (R-&#956;CP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning.">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures.">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li><li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo(ethylene+glycol)+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold.">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li><li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve...

Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin 1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir &quot;klik&quot; kimyaları da yerel konformasyonun 4-6&#39;da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları 6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır. Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka 8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP&#39;d genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı 10 arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu<html> bundan başka çeşitli kimyasal kısımların 11 sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir. Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik &quot;tık&quot; kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand 6 mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır. e_content &quot;&gt; Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP 12 adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle 13 kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize 6,14 ve diğerleri 7 tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.

<table><tbody><tr><td>SCARA&amp;nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Higher end models with increased precision are available if desired.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Requries specialized training.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&amp;mu;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requires rubber stoppers with diaphram.</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td></tr><tr><td>Methanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Copper(II) Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>2,2&#039;-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BSA) are available and serve this purpose.</td></tr><tr><td>12-Well Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td></tr></tbody></table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında 6 kanıtlanmıştır &quot;tıklayın&quot;. Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mik...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K Görüntüleme.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Video: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- µCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Biyoloji

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazları için 3D Baskı Uygulamaları

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

Yazar Spotlight: Beyin Fonksiyonlarını Analiz Etmek için Modüler Nöronal Ağlar

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazlarının İki Foton Polimerizasyonu 3D Baskısı

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...