The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

注：すべての手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に準拠して実施しました。推奨される材料および機器のリストを 、 表1に見ることができます。 1.組織標本<ol><li>かん流<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（25mgの/ kgのIP）の過剰摂取と齧歯類を安楽死させる、8 ml /分の流速で完全に放血（3-5分）まで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で経灌流。徹底的灌流手順については、ゲージら2012 9を参照してください。 </li><li>即時/分で8ミリリットルの流速で15〜20分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで灌流することにより、組織を固定する、PBSフラッシュを以下。 </li><li> （順番に、15％、30％、30％と、生理食塩水緩衝トリスで調製した）傾斜スクロース溶液、続いて、24時間、4％パラホルムアルデヒド中で脳と場所を削除4℃。その後のスクロース溶液Oに脳を転送NLY脳の後、各溶液中に沈めました。注：通常、各溶液中の5日は、シンクする組織のために十分な時間です​​。 </li></ol></li><li>組織の凍結および凍結切片化<ol><li>このようなOCT化合物として、メディアを埋め込むには、脳を置き、-35℃の温度でイソペンタンに沈めます。脳は最低10分間凍結し、次いで-80℃で保存することができます。温度に勤勉が取られていない問題が発生する場合があります。トラブルシューティング情報を説明を参照してください。 </li><li> 20μmの厚さ、-20℃の温度で連続冠状断面をカットします。正に荷電したスライド上に組織を収集します。脳切片を-80℃でジップトップバッグと格納されている長期的に箔に包まれたスライドボックス内に配置することができます。ストレージのこの方法は、空気や霜への暴露を防止するために、二重の境界線を作成します。 </li></ol></li></ol> 2.組織処理注：例の機器や材料R染色のためにequiredは、図3に示されている。代替が利用可能である、しかしながら、これらの画像は、免疫組織化学的染色に新しいものの前に適切な購買アイテムを可視化するために役立ちます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 図3：スライドは、箔のボックスをラップする必要がなく、光から保護されているように、免疫組織化学染色のために必要な例の項目（A）に示したブラックボックスは、免疫蛍光のための理想的な湿度室です。切片化後、スライドは、（B）に示すように黄色のボックスのボックスに保存することができます。ホイルでしっかり箱を包む前冷凍庫にジップトップバッグに配置すると、冷凍焼けから組織サンプルを保護するのに役立ちます。スライドの例は、E（異なる染色皿（D）に示されていると、（C）に示され</strong&gt;）。カバーガラスの厚さが1.2カバースリップは、ほとんど直立共焦点顕微鏡で撮影素晴らしい結果を提供する、大きさ及び厚さ（F）に変化することができます。このような（G）に示すような鉛筆スライドを標識するために使用することができます。インクを実行できるように恒久的なマーカーは、染色およびサンプルが何であるかを決定する能力の両方に影響を与え、避けるべきです。それは（H）に示すようなミニPAPペンは撥境界がスライド上に描画することが可能になります。 <ol><li>スライドの準備<ol><li>室温で冷凍庫と解凍からスライドを削除します。 <ol><li>オプション：セクションは、以前はスライドから浮いている場合は、スライドをオフに浮遊からの組織切片を防ぐためにこれ以上の4以上時間60℃のオーブン中で解凍したスライドを配置します。 </li></ol></li><li>スライドラックとそれに対応する皿にスライドを配置します。 </li><li>洗浄は、洗浄の間に溶液を変え、5分ごとに、PBSで3回スライドします。前進このステップから、sectiを回避長期間のための液体を取り付けずにONS。注意：セクションが乾燥した場合、バックグラウンド染色が増加し、意味のあるデータを確実に得ることができません。 </li></ol></li><li>組織染色<ol><li>光を通さない染色ボックスで、脱イオン水で浸したリントフリー組織と「湿度室」を作成。 </li><li>離れた組織切片から、スライドの非常にエッジに撥液性の境界線を作るためのミニPAPペンを使用し、糸くずの出ない組織とスライドの端を乾燥させます。この境界線は、液体のメニスカスと、その表面張力は染色に影響を与えないように、組織の縁部との間に十分なスペースを確保する必要があります。 注：目的の抗体は、マイクロ波抗原検索を必要としない場合は、PAPペン撥ボーダー前2.1.3に適用することができます。 PAPペンをPBS中で洗浄する前に適用されている場合は、撥液性の境界の整合性は、この段階でチェックする必要があります。国境のギャップを埋めるためにミニPAPペンを使用してください。 </li><liスライドを水平に配置して&gt;、ブロック非特異的抗原は、PBS（ブロッキング溶液）中の4％（v / v）の血清中でインキュベートすることにより結合します。室温で1時間のために、スライド当たりブロック溶液をピペットを300μl。ブロック·ソリューションは、スライドの端のPAPのペンに延びており、完全に組織の近くに表面張力によって引き起こされる不均一な染色を避けるために、組織をカバーしていることを確認します。 <ol><li>二次抗体が作られているのと同じ種からの血清を使用してください。注：この手順では、二次抗体は、ロバで行われ、したがって、ロバ血清が使用されます。二つ以上の異なる種に由来する二次抗体を使用する場合は、それぞれの種からの血清を含みます。 </li></ol></li><li>スライド上に一次抗体をピペット。注：この染色のための抗体の濃度が1で最適化されています：5000および1：それぞれIBA1とパン神経500、。これらの濃度は、バックグラウンド染色が存在しないと意味のある染色を示すことが見出されています。 <ol><li>にブロック溶液を希釈1％のPBS中の血清および一次抗体を追加します。スライドごとに1％の血清中の一次抗体溶液を300μlをピペット。ここでも、流体は、PAPペンの端にあることを確認してください。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> IBA1も汎神経も抗体を含有するもの、汎神経抗体なしIBA1と1、およびIBA1なしの汎神経抗体と1：3つの制御スライドを含めます。しかし、二次抗体の非特異的結合をテストするために、一次抗体を省略し、同じソリューションと同じ実行中にこれらのスライドを染色します。 </li></ol></li><li>翌朝、洗浄は洗浄の間に溶液を変更し、5分ごとに、PBSで3回スライドさせます。 </li><li>蛍光抗体は前進このステップから、黒や暗所でインキュベートされているか、洗浄容器が箔とのハイブリダイゼーションボックスに包まれて保証することにより、露光量を最小限に抑えるため、光に敏感です。すべてのスライドに適切な二次抗体をピペットインキュベート光を通さない「湿度室」のブロック溶液中の250（ステップ2.2.3を参照）（ステップ2.2.1を参照してください）​​：1の濃度で室温で60分。 <ol><li>波長の異なる二次抗体を使用してください。ここでは、一次抗体ウサギ抗IBA1ために、適切な二次抗体としてロバ抗ウサギ594を使用しています。一次抗体マウス抗パン神経については、適切な二次抗体としてロバ抗マウス488を使用しています。あるいは、抗ウサギ488及び抗マウス594を使用しています。 </li></ol></li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li><li>オプション：核染色を行います。 <ol><li>正確に60秒間の二重蒸留H 2 0で0.03μg/ mlの濃度でヘキストに入れ（または他の核染色）。 </li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li></ol></li><li>のddH 2 0で洗浄します。 </li></ol></li><li>カバースリップ<ol><li>このようなフルーア水性マウント媒体とカバーガラススライド、omount-GまたはProlongGold。綿棒を使用して、すべての気泡を除去するように注意してください。 注：他の取り付け剤を使用することができた、しかし高ブリードスルー色素間は、カバースリップの日以内に、いくつかのことで注目されています。 </li><li>蒸発による乾燥からセクションを防止、エッジをシールするために透明なマニキュアを使用してください。スライドは平坦では室温に放置し、その後、4℃でホイルで包み遮光容器に保管しながらマニキュアは遮光容器に乾燥することができます。 </li></ol></li></ol> 3.ステンド組織を画像<ol><li>顕微鏡検査<ol><li>暗い部屋で行われるべき、マニキュアは、顕微鏡検査を開始する前に少なくとも1時間乾燥することができます。 </li><li>蛍光光源とデジタルカメラアタッチメントと共焦点や研究顕微鏡を用いて顕微鏡写真を取得します。付属のソフトウェアを使用して、各波長の露光設定 - 405、488、594 - 別途。注：徹底的イメージング命令は顕微鏡メーカーからオンラインで利用可能であるべきです。 </li><li>セクションを移動したり、フォーカスを調整することなく、各チャネルの顕微鏡写真を取得します。カラーの画像を取るか、または交互にグレースケールで、その後色に変換します。 注意：色または各チャンネルからグレースケール画像を後処理にまとめることができます。 </li><li>セクションの光退色が発生するように、組織切片を長時間、周囲光や顕微鏡の光にさらされないことを確認してください。これを避けるために、増大する光/レーザー強度ではなく、露光時間を増加させます。 </li><li>オンされてから30分以内に蛍光光源をオフにしないでください。 注：立て続けにオンとオフのソースを切り替えるには、蛍光灯の寿命が低下することがあります。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この通信の全体的な目標は、読者に、免疫組織化学の手順を導入することでした。このため、IBA1とパン神経抗原と二重標識の例は、ミクログリアおよび灌流パラホルムアルデヒド中でニューロンを観察するために、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳を使用しました。 この技術は、無限の目的を果たすように構成することができます。脳、肺、肝臓、腎臓および?...

<html>免疫組織化学は、目的の抗原に特異的に結合する一次抗体を用いて、組織切片中の抗原（ すなわち、タンパク質）を検出するための処理です。免疫組織化学は、彼は抗体が大きな特異性1と抗原を局所化できることを決定し1934年にJR Marrackによって開拓されました。 1942年に始まって、免疫組織化学を可視化する蛍光抗体を用いた研究in vitroでの最初の一部は、 生体組織化学的研究では 、まず、4を発表した後の2,3を 、発表されました。 1960年代の間に、三十年免疫組織化学的方法の開始後に、酵素標識抗体を二次試薬として使用されるようになりました。これらの方法は、同時に独立し、フランスと米国の5,6に開発されました。今日では、抗体の広い配列は、免疫組織化学研究の7のための無限の可能性を提供します。 &quot;&gt;この対応の全体的な目標は、免疫組織染色への簡単な紹介を提供することにある。それは、この技術の包括的かつ徹底的な見直しとなるものではありません概説した方法では、2つの抗原のための免疫組織化学的技術は、ミクログリアのために（マーカーを提示しています。パラホルムアルデヒド灌流、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳の染色のためのニューロン）。免疫組織化学染色は、バックグラウンド染色を低減するために非特異的抗原を遮断することから始まる。次に、一次抗体とのインキュベーションは、組織内の特定の抗原に結合することができます。一次抗体に続いて、別の抗体、二次抗体と呼ばれる、共役可視化信号8に一次抗体をリンクするために適用される。二次抗体は、一次抗体が発生された種に特異的な免疫グロブリンG（IgG）ドメインを標的とする。二次抗体は、シグナルを増幅します一次抗体のTののFab領域のため、彼一次抗体のIgGのドメイン上の複数のサイトへの二次抗体に結合します。二次抗体のF C領域に結合させ、酵素または蛍光分子は、可視化を可能にします。例えば、ウサギ抗IBA1一次抗体はIBA1に特異的なウサギIgG分子です。ロバ抗ウサギIgGを二次抗体として適用した場合、それを認識し、ウサギ抗IBA1 IgGの複数の領域（ 図1参照）に結合します。ロバ抗体は、種々の方法によって可視化することができます。この対応は、蛍光顕微鏡により可視化するために、一次抗体を認識する二次抗体にコンジュゲート蛍光団の検出に焦点を当てています。蛍光免疫組織化学では、例えば、ヘキスト又はDAPIなどの核染色はすべての核を可視化するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 図1：のSch直接対間接的な抗体の標識技術のematic表現抗体は、目的の抗原に結合し、一次抗体の種に対して惹起二次抗体によって増幅することができます。この技術は、増幅およびDAB可視化のための（A）、または直接結合蛍光二次抗体（B）は、アビジン-ビオチン複合体（ABC）を用いて行うことができます。あるいは、一次抗体を直接ビオチンまたは蛍光団（C）を含む多くの異なるタグを用いて結合させることができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 免疫組織化学的染色を視覚化するための別の方法は、（DAB、 図1および図2を参照）3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを使用しています。これは、ビオチン化を用いて、蛍光とは異なる、または明視野顕微鏡下に表示されている沈殿物にDABを変換する酵素を提供するホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体。単一の抗原に関心があるか、染色が長く持続することが要求される事例では、DABは、蛍光染色よりも適切な場合があります。しかし、DAB染色は、2つの核抗原が注目されている場合は特に、複数のマーカーの間の区別には適していません。 DAB材料およびプロトコルの変更については、 表1を参照してください。代わりに、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（NBT / BCIP）は、アルカリホスファターゼ（AP）を可視化するために用いることができる共役二抗体。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 図2：ニッケル強化DAB単一標識ラット脳組織切片の代表的な画像ラット脳SEIBA1用ニッケル強化DAB（A）で標識し、汎神経されctions（B）は、単独でミクログリアまたは神経細胞の長期的な分析を可能にします。スケールバーは20μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 一つは、分析されている組織内の目的の抗原の推定豊かさを考慮する必要があります。間接的な方法には​​、（上記のように）低量と目標のために有用です。目的の抗原が多量である場合、直接法を適用することができます。直接法は、直接可視化信号に結合している一次抗体を伴う、したがって、二次抗体は必要ありません。この方法は、染色プロセスを簡略化するが、間接的な方法によって達成増幅を排除します。直接結合一次抗体を使用すると、二次抗体の交差反応性を排除しますときに二重標識。 この通信は、IBA1とパンニューロン（ 表1の詳細）で二重標識のためのプロトコルの詳細について説明します。 IBA1は分岐し、ハイパー分岐し、活性化され、アメーバ状、及びロッドを含む多くの活性化状態において、ミクログリアを染色します。汎神経汚れ神経の軸索、樹状突起、およびソーマ。 IBA1が最もミクログリアとパン神経標的ニューロンを染色するので、汚れのこの組み合わせは、ミクログリア - ニューロン相互作用の広範な理解を得るのに有用です。 要するに、免疫組織化学染色は、抗体の慎重な選択に依存しています。調査の質問は、より具体的になるように、代替の抗原に対して惹起された抗体が所望され得ます。特定のミクログリアの活性化状態をターゲットとするためには、むしろIBA1よりも、CD45またはCD68抗体を使用することを選択することができます。また、マウスでの作業中に、F4 / 80は、必要な結果を提供することができます。同様に、神経細胞の要素は、具体的には、抗体のRAで標的とすることができます核に対するised、シナプス（前または後）、軸索と成長円錐。さらに、ニューロン（ダブルコルチン、のNeuN）の年齢を区別する他のマーカー、および神経再生（GAP-43）があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

免疫組織化学は、 その場での抗原の存在、位置、および相対的な存在量を検出するために広く用いられている技術です。この入門レベルのプロトコルは、試薬、装置、一例として、ミクログリアおよび神経要素のためのマーカーを用いて、げっ歯類の脳組織の免疫組織化学的染色を完了するために必要な技術を記載しています。具体的には、本論文では、それぞれIBA1と汎神経、免疫組織化学のために介してミクログリアと神経細胞の蛍光可視化するためのステップバイステップのプロトコルです。蛍光二重標識は、正確な細胞型、受容体、リガンドの間の相互作用を観察する機会を提供し、同じ試料中の複数のタンパク質の局在化のために特に有用であり、及び/又は互いにならびにタンパク質共に関連する細胞外マトリックス単一細胞内の局在。他の可視化技術とは異なり、蛍光免疫組織化学染色の強度が低下することがで適切な予防措置が取られない限り、染色後数週間​​から数ヶ月。蛍光はより多くの時間が効率的であり、2つ以上の間でより正確な区別を可能にするように、この制限にもかかわらず、多くの用途において蛍光二重標識は、3,3&#39;-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）またはアルカリホスファターゼ（AP）などの選択肢よりも好ましいですマーカー。議論は成功を促進するために、トラブルシューティングのヒントやアドバイスが含まれています。

この染色プロトコルミクログリア蛍光594チャネル（赤）で標識されているラット脳組織切片をもたらし、488チャンネルで標識されたニューロン（緑は、 図4を参照します）。核染色が行われた場合には、チャネル405（青）で表示されます。画像は、異なるチャネルに取り、3つのチャネルの直接比較のために重ね、または2つのチャンネル間ことができます。多くのデジタル取得ソ?...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K ビュー.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

ビデオ: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

神経科学

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.