プロトコルの全体的な目標は、生きている成人の人間の脳組織から原発性ミクログリア細胞を分離することです。我々の場合、これは手術中に外科用窓として収集された。これは、最初に氷冷PBSで脳組織を収集することによって達成され、組織は1mmキューブの小片にダイシングされ、私はちょうどトリプシンEDTAの助けを借りて行った。
これに続いて、細胞は遠心分離によって収穫され、アンドロゲン細胞培養に適したフラスコで48時間メッキされる。細胞はフラスコからもう一度収穫され、さらに使用されるまで培養される。原発性ヒトミクログリア細胞は、免疫細胞化学を用いて特徴付けることができ、さらなる実験に使用することができる。
成人のヒト脳組織からミクログリア細胞を単離するためのプロトコルの主な利点は、非常に費用対効果の高い方法で原発性成人ヒトミクログリア細胞を効果的に提供することです。このプロトコルは堅牢であり、既存のプロトコルで使用されるステップ数を減らすことでセルの損失を減らします。10 mLの氷冷aCSFを含む50mLファルコンチューブに組織を集める。
70%アルコールで回収管を丁寧に拭き取り、無菌層空気流室に移します。aCSFを慎重に廃棄し、ファルコンチューブ内の組織を計量します。空のファルコンチューブの重量を推定することによって、組織のおよその重量を計算します。
37度摂氏に新鮮なaCSFを温めます。組織を暖かいaCSFに5分間保管してください。このステップは細胞死を避けるために重要です。
aCSF を慎重に破棄してください。そして、1X PBSで一度組織を37度に温めます。必要に応じて、PBSを繰り返し洗浄して、すべての血液を洗い流してください。
組織を温かいPBSで5分間インキュベートする。PBS の半分を慎重に破棄します。残りのPBSと一緒に組織を殺菌されたペトリ皿に移す。
残りのPBSを1-mLピペットで慎重に取り除いてください。これは、組織の損失を防ぐことができます.滅菌メスを使用して少なくとも1ミリメートルキューブの小片に出すダイス。
ペトリ皿に0.25%トリプシンEDTAの2 mLを加え、ピペットの助けを借りてプレートを十分に洗います。0.25%トリプシンEDTAのグラム組織あたり10 mLを含む50 mLファルコンチューブにダイシングされた組織を移す。10 mL血清ピペットを通してピペットで混ぜます。
37°Cで30分間、250rpmの速度でシェーカーにチューブをインキュベートします。トリプシンを中和するために中和媒体の10 mLを追加します。10 mL血清ピペットと十分に混ぜます。
チューブを摂氏4度で2000Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを培地1mLで再懸濁する。アンドロゲン細胞に適したT25フラスコに細胞を置き、4 mLの培地を追加します。
培養培地は、20%L929上清および1%ストレプトマイシンを含有する。L929上清をストック培地に添加するのではなく、フラスコに別途添加することをお勧めします。我々は、均質に組織を処分するフラスコで終了しています。
これは、汚染の可能性を高める可能性があるため、揺れながらフラスコの首にメディアを持ち込まないようにしてください。フラスコを摂氏37度で5%CO2で48時間インキュベートします。遠心チューブで0日目に作製したT25培養フラスコから培地を収集します。
摂氏4度で1,466Gで収集した培地を4分間遠心分離する。収集した培地が遠心分離されている間、1日0フラスコを1X PBSで1回洗います。フラスコを軽く振って残った組織の断片を取り除きます。
残骸は培養に悪影響を及ぼさないため、フラスコの過酷な揺れを避けてください。フラスコに5mLの新鮮な培養培地を加えます。遠心チューブから上清を捨てます。
1 mLの培養液をチューブの1つに加え、ピペットと十分に混ぜます。他のチューブに細胞と混合メディアを連続して追加し、十分に混合します。アンドロゲン細胞に適した別のT25フラスコに細胞を置きます。
フラスコに4mLの新鮮な培養培地を加えます。5%CO2で37度でフラスコを48時間インキュベートします。フラスコから培地を捨て、新鮮な5mL培養培地を追加します。
5%CO2で37度でフラスコを48時間インキュベートします。6日目には、細胞はさらなる実験の準備ができています。ここに表される画像で。
セクションの第1パネル GFAPで染色されたアストロサイト、緑色。第2のパネルでは、セクションAのRCAを有するミクログリア染色、緑色。セクションBミクログリアは、色が緑色であるRCAで染色され、アストロサイトはGFAP、赤色の色で染色されています。
画像のオーバーレイは、ミクログリアとアストロサイトを一緒に示しています。画像からは、調製した培養中の細胞の大部分がミクログリアであることは明らかである。画像をブラインドコントロールによって定量化し、その結果がC節で表され、その結果、調製した培養中の細胞の約80%がミクログリア細胞であることを示した。
この技術は約1時間半で行うことができる。この手順に従って、私は下流の実験にさらに使用することができる成人の人間の脳組織からプライミングミクログリアを選択する方法をよく理解する必要があります。
