RVSはイェシーバー大学のアルバート·アインシュタイン医科大学からのスタートアップ資金を新たな捜査官でサポートされています。

1。動物の灌流および小脳の解剖<ol><li>蛋白質に応じて、灌流が成功した染色1,2のために不可欠である可能性があります。経心臓的に灌流は麻酔薬の適切な使用を必要とする侵襲的、非生存の手順です。正しいトレーニング、制度の承認、およびIACUC承認はすべての手順を実行する前に必要です。それは、常に実験的な要件を識別し、適切なトレーニングを取得するにヘルプを表示するには、金融機関の獣医師に相談することをお勧めします。手順の前に、動物は、深く麻酔し、そのような足や尾のピンチのような刺激に応答しない必要があります。を使用してはさみで腹部の皮膚や筋肉の壁にカットを作成し、次にそれぞれの側で胸骨に隣接して切断することによって胸郭を開き続けています。さらに、実験者は横隔膜を囲む筋膜を切断することにより大容量の内部作業スペースを作成することができます。腹部と胸壁スペリオを持ち上げることによってRLY、心臓は現在公開されます。流出するとすぐに左心室に灌流針を挿入するための血液を可能にするために右心房に小さなカットを行います。基本的な水圧ポンプ（詳細については、 表1を参照）灌流ソリューションを提供することが好ましい。最初に、0.1Mリン酸と血液を洗い流す流体を明確に実行されるまで（PBS、 表3を参照）緩衝生理食塩水。次に、水圧ポンプをオフにしてすぐにPBSで希釈した4％パラホルムアルデヒドのコンテナ（PFA、 表3を参照）へのソリューション提供チューブを切り替えて固定を提供するために戻ってポンプを回します。ポンプの使用は必要ありません：実際に、PBSおよび4％PFAで満たされた2つのシリンジは徐々にソリューションを提供するために使用することができます。 </li><li>それは慎重に組織に任意の病変を導入することなく、頭蓋骨の脳を解剖することが重要です。解剖時の脳に小さな裂傷が徐々に目に見える岩の割れ目に展開されているトラップは、抗体と組織の処理（ 図2、例えば赤色のアスタリスク）の間に人為的な染色の原因となります。小脳の解剖のために、それは頭の真ん中に皮膚を切って、ゆっくり頭蓋骨を露出させるフラップを離れてからかうように典型的である。背側正中線に沿って、また横方向に頭蓋骨の両側に沿って前方へ後から頭蓋骨を切り取ります。これは小脳をニッキングの危険性を実行時にブレグマを超えて切断しないでください。鉗子を使用すると、そっと離れて髄膜に接続されている脳組織を離れて引き裂くないように注意して脳から頭蓋骨の前部を持ち上げます。脳の腹側の脳神経を切断する。 </li><li>脳の残りの部分から小脳の分離は、2つの理由から重要です。まず、in situでの丘で、ビューから隠されている前葉における発現パターンの探査が可能になります。二つ目は小さく、孤立した領域に組織を分離するmに対してできることですいくつかのタンパク質の染色を容易にすることができる鉱石を完全に固定。この最後の解剖ステップを通して、ケアは鉗子の先端を小脳に触れないように注意する必要があります。スーペリア、下丘の中央に鉗子のペアの先端を挿入します。鉗子の2番目のセットでゆっくりと小脳から下丘を離れていじめる。次に、その前方側がダウンして直面していると脳幹が上向きになるように小脳を置きます。脳幹と小脳の小葉IX / Xの間に第四脳室に鉗子を挿入します。両側に鉗子でつまんで柄をカットして、そっと離れて脳幹から小脳を持ち​​上げます。小脳が分離された後、24〜48時間の最低4℃で4％PFAに浸漬することにより、それをポスト修正。小脳は、長時間の4％PFAに格納することができます。髄膜の前または発現パターンの視認性のために染色後のいずれかを削除する必要があります。実験では、小脳が処理中にニックれることを強い可能性がある染色する前に、髄膜を除去するために選択した場合。彼らは弱いバックグラウンド染色を取得し、後処理虚弱になった後見つけることが容易になるので、染色手順の最後に離れて髄膜を剥離することがはるかに簡単です。 </li></ol> 2。 Wholemount染色のための組織を処理する wholemount染色のアプローチは、組織切片の免疫組織化学染色よりも長い時間がかかるので、（ 表2）提供されるサンプルカレンダーに示すように各実験のためにタイムラインを計画しておくと便利です。開始する前に、心に留めておくべきいくつかの重要なものがあります。 1）組織を含むマイクロチューブは、凍結/融解プロセス中を除いて、すべての回でnutator上で回転させなければなりません。 2）いくつかのソリューションは、（溶液のレシピについては、 表3を参照）、各実験のために新鮮行わなければなりません。 3）プロトコルを通じて、ソリューションを変更したときに、優しく小脳に触れないようにではなく、鉗子で小脳を除去するよりも過ごしたソリューションを注ぐ。その後、別のコンテナに新しいソリューションを混合した後、穏やかにチューブに新鮮な溶液を追加するには、ピペットを使用しています。 2.1 1日目： <ol class="lalpha"><li> nutatorを穏やかに揺らし6-8時間室温でデントの修正3の小脳を修正します。メタノールは、抗原を破壊するである場合は、抗原の検索メソッドを使用して2.3Aを通して2.1Aステップを置き換えることを検討してください。抗原検索のために使用される熱とバッファは、抗体の浸透のための組織を準備するのに役立ちます。 </li><li>一晩4デントのブリーチ3ブリーチ小脳℃の</li></ol> 2.2 2日目： <ol class="lalpha"><li> 30分ごとに室温で100％メタノールの2回のラウンドで小脳を脱水。 </li><li>その後、件名、ソリューションの浸透を高めるために凍結/融解サイクルを一連の組織。慎重に30分間ドライアイス凍結容器にチューブを配置します。その後、チューブを取り外し、15分のためにベンチに室温で放置します。凍結/解凍の手順を4回（少なくとも）を実行する必要があります。 </li><li>組織の融解最後の後、一晩-80℃の冷凍庫にチューブを配置します。 </li><li>組織は、°C、すぐに凍結/融解のステップの前または後に-80℃で長期間保存することができます。それ以外の場合、プロトコルは継続すべきである。 </li></ol> 2.3 3日目： <ol class="lalpha"><li>室温で60-90分ごとに、50％MeOH/50％PBSで15％MeOH/85％PBS、100％PBS、それを洗浄することにより、小脳を再水和。 </li><li>次に、成体マウス小脳、対象2〜3分間、PBS中の10μg/mlのプロテ​​イナーゼKによる酵素消化に対する組織のために。全く消化ステップは、若い動物の小脳（マウスでP5または以下）のために必要ではありません。長いdigestionが大きな脳のために提案されています。例えば、消化は、霊長類の脳4の5-6分のように高くなる可能性があります。 </li><li>消化後、すぐにプロテイナーゼKを削除するには、室温で10分間ずつPBSで3回小脳を洗う</li><li> 4℃で一晩（ 表3を参照）PMTに組織をブロック℃、それが安価であるので、ミルクパウダーは、しばしばタンパク質の作業のためのブロッキング剤を選択する最初の選択肢であり、効果的にバックグラウンド染色を低減し、通常抗体の結合または抗原へのアクセスを妨げることはありません。実験者は追加コストを認識しておく必要があり、最初の交差反応性免疫グロブリンおよび対雑音比を最適な信号を生成する能力について血清の品質をテストする必要がありますが、動物の血清はまた、使用することができます。 </li></ol> 2.4日4-5： <ol class="lalpha"><li> 4℃（LARGで48時間、5％DMSOを添加した光電子増倍管で希釈した一次抗体で組織をインキュベートER小脳）が増加したインキュベーション時間が必要になります。 </li></ol> 2.5 6日目： <ol class="lalpha"><li>バインドされていない一次抗体を除去するために4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2〜3回洗浄します。 </li><li>その後、4℃、5％DMSO℃で一晩（大きな小脳が増加インキュベーション時間が必要な場合があります）とPMTを含む溶液中で二次抗体で組織をインキュベートします。 </li></ol> 2.6 7日目： <ol class="lalpha"><li> 4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2-3回を洗う</li><li>組織の1-2時間PBT（ 表3を参照）、最終的な洗浄を与えます。このステップでは、過剰な牛乳を除去し、染色の透明性を高めます。 </li><li>最適な染色強度に達するまで、最後に、DAB（3,3 &#39; - ジアミノベンジジン）溶液中で組織をインキュベートします。褐色の反応生成物は約10分以内にはっきりと見えるはずです。光が析出する発色の原因としては、暗闇の中でDABを使用するのが最適ですバックグラウンド染色を増やすことができ、TE、。 </li></ol> 2.7 最適な染色強度に達したときに、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBS中で小脳を配置することによって反応を停止します。組織はこのソリューションでは、長期保存することができます。アジ化ナトリウムは、細菌増殖の強力な阻害剤であるが、それはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼを阻害するとして、このステップまでは避けるべきである。 2.8オプションの増幅の手順： 通常のプロトコルに従うが、これらの手順は、上記の手順2.5B-2.7の代わりに実行する必要があります。 <ol class="lalpha"><li> 4℃で一晩組織をインキュベート℃、5％DMSOとPBSTでビオチン標識二次抗体のC（ 表3を参照）。 </li><li> 2〜3時間室温でPBST 3-4変化の各組織を洗浄します。 </li><li> 4℃で一晩小脳をインキュベートPBSTでABC複雑なソリューションのC。 </li><li>で2-3時間ごとに組織をすすぐPBSの3-4の変化で室温。 </li><li>上記のように、新たに調製したDAB溶液中で組織をインキュベートします。 </li><li>染色が最適である場合には、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBSで小脳を洗浄することにより反応を停止します。 </li></ol> 3。イメージング染色された組織<ol><li> Wholemount画像を使用してキャプチャすることができ、例えば、ライカDFC3000 FXカメラは、ライカアプリケーションスイートFXソフトウェアを実行しているライカMZ16 FAの実体顕微鏡に取り付けられた。必要に応じて、デコンボリューション顕微鏡は、各画像が鮮明な焦点にのみ、単一の小葉を持つことに、別の焦点面に複数の連続した​​画像を取得するために使用することができます。次に、画像は歪みを除去するためにレンダリングされた単一のスタックとソフトウェアに圧縮することができます。最終的な合成画像は、明確な焦点で表示されているすべてのパターニングと小脳の表面発現パターンを説明します。 </li><li> PBS（または与える別の媒体に浸漬しながらWholemount染色された組織を撮像する必要があります最適な屈折率）。簡単にイメージングのためのwholemountを配置するために、プラスチック製のシャーレに1％寒天ゲルを作る。ゲルに小さな穴をカットします。穴は、小脳が所望の向きに挟まれるようになります。 </li><li>生データは、Adobe Photoshop CS4にインポートして、コントラストと明るさのレベルに調整されます。 </li></ol>動物すべての動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の制度のガイドラインに従って承認されたIACUC動物のプロトコルの下で行われた。男性と女性の非近交系スイスウェブスター（タコ、アルバニー、NY）マウス我々のコロニーで維持され、すべての試験に用いた。安楽死させた成体ラットは、親切に博士Bryenヨルダン（アルバート·アインシュタイン医科大学）によって提供されていました。すべての動物は、少なくとも1ヶ月であった。 4。代表的な結果小脳は、4つの横のゾーンに分子の発現によって区画されています。前方のゾーン（A〜Z：〜葉IV）、中央ゾーン（CZ：〜葉VI-VII）、後方ゾーン（PZ：〜葉VIII-背IX）と結節ゾーン（NZ：〜葉IX腹とX 5）。各ゾーンには、矢状ストライプ1,2,5,6（ 図1）のユニークな配列が含まれています。プルキンエ細胞におけるZebrinII式では、AZとPZ（ 図2）とCZとNZ（ 図2）の均一な発現のストライプを明らかにする。プルキンエ細胞の矢状組織は求心性線維の末端フィールドの地形によってミラー化されます。コカインとアンフェタミン調節転写産物（CART）のペプチドは、登山繊維（ 図3a）のサブセットに発現していることが小脳皮質7（ 図3b）の分子層におけるプルキンエ細胞の樹状突起のストライプのプロジェクト。このような増幅7のような適切な変更と共に、wholemountプロトコルは旧姓なく、オリーブ小脳のパターンの可視化を可能にする染色組織切片（ 図3b）から骨の折れる、時間のかかる再構成のためのD。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> 図1：A. ZebrinII / aldolaseC式では、小脳の横断面における矢状バンドを明らかにする。スケールバー= 500μmである。B. ZebrinII / aldolaseCは、プルキンエ細胞の細胞体と樹状突起で排他的に発現している。スケールバー=150μmの（GL =顆粒層、PCL =プルキンエ細胞層、ML =分子層）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> 図2。ZebrinII / aldolaseCが前方（AZ）、中央（CZ）、小脳の後部（PZ）のゾーンの画像にプルキンエ細胞のストライプを表示するために染色wholemount小脳。ここで我々はまた、小脳をニッキングの負の結果の例を示します。得られた人工染色が示されている赤いアスタリスク（*）である。スケールバー= 1ミリメートル（LS =単小葉、PML =傍小葉、COP =コピュラpyramidis）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> 図3 A. CARTは、分子層の光ファイバ端末の登山で表されます。スケールバー= 100μmである。（ML =分子層、PCL =プルキンエ細胞層、GL =顆粒層）NZでCARTの発現B. Wholemount免疫組織化学。スケールバー= 2ミリメートル（COP =コピュラpyramidis、PML =傍小葉、PFL = paraflocculus、FL =片葉）。

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我々は、開示することは何もありません。

我々の開発および成人の脳内タンパク質の発現を明らかにするための多彩な免疫組織化学的アプローチを用いて成功したwholemount染色するために必要な技術的な詳細を説明してきました。このアプローチを使用することにより、複雑な分子の発現パターンを解析することができ、脳の地形は、手間と時間がかかり、組織切片の手順を必要とせずに感謝しています。 このプ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> プロトコルの機能 </td></tr><tr><td>灌流ポンプ（フィッシャーScientific/13-876-2） </td><td>一貫性のあるゆっくりと血流を可能にします。 </td></tr><tr><td>鋭い先端はさみ（FST/14081-08） </td><td>潅流および解剖の一般的な使用。 </td></tr><tr><td>鈍先端鉗子（FST/91100-12） </td><td>灌流針を挿入するための心を安定させます。 </td></tr><tr><td>鉗子（デュモンAA/11210-10によってFST） </td><td>頭蓋骨から脳の解剖時に使用するために、脳の残りの部分から小脳を分離する。彼らは解剖時の小脳へのダメージを最小限に抑えることが少し丸みのヒントを持っているので、これらは不可欠です。 </td></tr><tr><td> Nutator（フィッシャーサイエンティフィック） </td><td>潜伏期間中に運動を組織を維持するために使用されます。 </td></tr><tr><td> 1.5 mlチューブ（ザルスタット/スクリューキャップマイクロチューブ） </td><td>彼のすべてのステップtochemistryプロトコルは、これらのマイクロチューブで行われます。丸い底は小脳が運動に留まることが保証されます。 </td></tr><tr><td>穴あきスプーン（FST/10370-17） </td><td>穏やかに過ごしたソリューションをデカントしながらマイクロチューブにwholemountsを維持するために使用されます。 </td></tr><tr><td>ライカMZ16 FA顕微鏡</td><td> wholemount染色を調べるために使用されます。 </td></tr><tr><td>ライカDFC3000 FXカメラ</td><td> wholemount画像をキャプチャするために使用されます。 </td></tr></tbody></table> 表1。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> 典型的なwholemount実験例のカレンダー </td></tr><tr><td> 1日目</td><td colspan="4">デントの修正、室温、8時間</td><td colspan="4">デントの漂白剤、4℃、一晩</td></tr><tr><td> 2日目</td><td colspan="3"> 100パーセントメタノール、室温、2倍、30分ごとに</td><td colspan="3"> 100％メタノール、凍結/融解、 4X、30 min/15分</td><td colspa<html> N = &quot;2&quot;&gt; 100％メタノール、-80℃、一晩</td></tr><tr><td> 3日目</td><td> 50パーセントMeOH/50％PBS、室温、60から90分</td><td colspan="2"> 15パーセントメタノール/ 85％PBS、室温、60から90分</td><td colspan="2"> 100パーセントPBS、室温、60から90分</td><td> PBSで10μg/mlのプロテ​​イナーゼK、室温、2〜3分</td><td> 3倍の100パーセントPBS、室温、10分ごとに</td><td> PMT、4℃、一晩</td></tr><tr><td>日4月5日</td><td colspan="8"> PMT + 1°抗体+ 5％DMSO、4℃、48時間</td></tr><tr><td> 6日目</td><td colspan="3"> PMT、4℃、2〜3倍、2〜3時間ごと</td><td colspan="5"> PMT + 2°抗体+ 5％DMSO、4℃、24時間（またはABC複合体を増幅ステップを始める） </td></tr><tr><td> 7日目</td><td colspan="2"> PMT、4℃、2〜3倍、2〜3時間ごと</td><td colspan="3"> PBT、室温、2時間</td><td colspan="3">最適な染色で可視化されるまで、PBS中の新鮮なDABでインキュベート</td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; 表2。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> レシピは （* =たびに新鮮な準備） </td></tr><tr><td> PBS（リン酸緩衝生理食塩水） </td><td> 0.1Mリン酸は、脱イオン水で緩衝化生理食塩水。 pHは7.2（シグマ錠剤; P4417） </td></tr><tr><td> PFA（パラホルムアルデヒド） </td><td>行われ、格納されて、ワーキング溶液をPBS中4％に希釈し、20％溶液として凍結して（; T353フィッシャーサイエンティフィック） </td></tr><tr><td>デントの固定液3 * </td><td> 4部のメタノール 1部のジメチルスルホキシド（DMSO、フィッシャーサイエンティフィック、D159-4） </td></tr><tr><td>デントのブリーチ3 * </td><td> 4部のメタノール 1部のジメチルスルホキシド（DMSO、フィッシャーサイエンティフィック、D159-4） 1部の30％過酸化水素</td></tr><tr><td>酵素消化</td><td> PBS中で、Proteinase Kを10μg/ mlの（03115828001ロシュ·ダイアグノスティックス）。 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBSを含む： 0.1％ツイーン20（FisheR·サイエンティフィック、BP337、トリトンは、すべてのインスタンスにTween-20を代わりに使用することもできます）。 </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBSを含む： 2パーセント無脂肪のスキムミルク粉末（カーネーションが望ましい） 0.1％ツイーン20（フィッシャーサイエンティフィック、BP337） </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBSを含む： 0.2％ウシ血清アルブミン（シグマ社製; B9001S） 0.1％ツイーン20（フィッシャーサイエンティフィック、BP337） </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> PBSの40mlに、3,3 - ジアミノベンジジンの1つの10 mg錠（D5905 Sigma-Aldrich社）を溶解する。 ）反応を開始する30％の過酸化水素10μlを加えて下さい。 </td></tr><tr><td> ABC複雑なソリューション</td><td>ベクタステインキット（ベクターラボラトリーズ社、PK-4000） </td></tr></tbody></table> 表3。

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

小脳の繰り返し、十分に理解細胞のアーキテクチャでは、脳の地形を探索するのに理想的なモデルシステムを確認します。比較的均一な細胞構築の基礎となると、遺伝子およびタンパク質発現の矢ドメインの複雑な配列です。小脳の分子区画は、求心性線維の解剖学的および機能的な組織によってミラーリングされています。完全に小脳組織の複雑さを理解するために我々は、以前はマウス小脳におけるパターン欠陥のハイスループット分析のためのwholemount染色アプローチを洗練された。このプロトコルは、詳細で正常にwholemount免疫染色を用いて成体マウス小脳におけるタンパク質の発現パターンを明らかにするために有用である試薬、ツール、および実用的な手順について説明します。手順はここで脳の微細な地形は、そのに明らかにすることができる方法の例としてzebrinII / aldolaseCの式を使用してこの方法の有用性を示す強調表示されたネイティブの三次元立体配座。についても説明し、分子の地形の比較研究のための求心性の予測および大型小脳におけるタンパク質発現の可視化を可能にするプロトコルへの適応があります。これらのアプリケーションを説明するために、ラット小脳の求心性染色からのデータが含まれています。

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K ビュー.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. 神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

脳室下帯恩顔：Wholemount染色と上衣の流れ

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

神経科学

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...