Name: isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
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This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

注：動物は維持され、施設のガイドラインに準拠して処理され、すべての動物の手順はインペリアルカレッジの動物保護によって承認されたと倫理審査機関（AWERB）とホームオフィス、ハーバード大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）し、連邦および州の規制に準拠した。 1.試薬と機器のセットアップ<ol><li>解凍し、アリコートし、-80ºCで保存し、1mg / mlのラミニンソリューション。 1~2μgの/ cm 2のコーティング濃度で得られた1mlのDMEM / F12中で2μlの溶解する。 注：氷上で解凍ラミニンゆっくりと冷たいDMEM / F12に溶解し、直ちにプレート/カバーガラスに追加します。 </li><li> 4ºCで0.01％の425ミリリットルのPBS中のポリ-L-オルニチン、店舗の75ミリリットルに希釈する。 注：作業溶液の貯蔵寿命は1ヶ月までです。 </li><li>がたまでために、4℃で25％（wt / vol）のPBS中のBSA、pH7.4で、店舗を溶解AR。 </li><li> （HBSS中）は、50％FBS失活メディアを準備します。 </li><li> - （+） - グルコース（重量/体積）、0.25％のBSA（重量/体積）の50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1×N2サプリメント、5％（容量/容量）FBS、0.36％のDを追加することによって、完全培地を調製4ºCでのDMEM / F12とストア。 注：貯蔵寿命は10日までです。 </li><li>グリースとオートクレーブの痕跡を除去するために少なくとも30分間、70％（体積/体積）エタノール沸騰置きカバーガラス。 </li><li>場所の24ウェルプレート中のカバーガラスと、各ウェルに500μlのポリ-L-オルニチン溶液を加える。 RTでの組織培養フードの下で1時間インキュベートし、その後、500μlの水で3回洗浄する。各プレートに500μlのラミニン溶液を添加し、37ºCの加湿組織培養インキュベーターでO / Nインキュベートする。 注記：洗浄は、24時間培養後、細胞の死をポリ-L-オルニチンで3回以上の結果を洗浄し、ラミニン処理後に必要でないが。 </li><li>天然ガスやトーチF上のガラスピペットの先端を磨くラメ。 注：このステップの後、先端の直径は、通常のサイズの約半分である必要があります。 </li><li>オートクレーブはさみとオートクレーブを用いて、1.5ミリリットルマイクロチューブのキャップをカット。 </li></ol>胚腹側中脳の2解剖<ol><li>麻酔をかけるには、CO 2吸入によって（E12.5）ダム妊娠タイムアウトした後、頚椎脱臼により安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールで腹部をスプレーし、子宮嚢がすべて露出するまで腹部切開を作る。鉗子を使用すると、膣の添付ファイルをカットし、子宮を取り除く。 100ミリメートルペトリ皿に、氷冷HBSS中で子宮を置きます。 </li><li>鉗子（ 図1C）を使用して、子宮と羊膜嚢から胚を削除します。新鮮な氷のように冷たいHBSS中で胚を置きます。 メモ： 図1Dに長方形は胚の腹側中脳の位置を示している。 </li><li>解剖顕微鏡（10倍の倍率）の下で胚を置き、中脳を解剖bioscissorと鉗子を（ 図1Eは 、切開のラインに対して図1Aを参照してください）を使用して、地峡と中脳、間脳境界領域で脳を切断することによりアーチ。 </li><li>全体中脳を取り出した後、背内側中脳（ 図1F）でカットをする。 </li><li> 2鉗子（ 図1H）を使用して、髄膜を削除します。 注：重要なステップ：このステップは、最適な神経細胞の収量と生存に不可欠である。培養条件は、脳細胞のために最適であるため、周囲の組織からの細胞のほとんどは、めっき後に死亡し、この組織からのアポトーシスシグナルは培養物の完全性に損傷を与えることができる。 </li><li>滅菌シェービングブレード（ 図1H、I）を使用して、蝶形状を観察し、各翼の約半分を切断するためにペトリ皿に脳組織を平らにする。 メモ： 図1Jは、孤立した腹側中脳を示している。 </li><li>転送15ミリリットルコニカルチューブ中の氷冷HBSSに腹側中脳の部分と次の胚を進める。 注：手順2.1から2.8には1時間以上を服用してはいけません。氷上でこの時間枠を越えて胚を維持することが有意に細胞生存率を減少させる。 </li></ol>腹側中脳細胞の3解離<ol><li>層流フードの下で腹側中脳の部分を転送します。 HBSSを削除し、（腹側中脳の最大12個のために十分なボリューム）をコニカルチューブに予め温め1ミリリットル（37℃）0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5〜10分間37ºCでの組織をインキュベートする。 </li><li>ボンネットの下にトリプシン-EDTAを削除し、組織に1ミリリットルの脱活性化培地を（血清はトリプシンを非アクティブにします）を追加します。 </li><li>非アクティブ化媒体を除去し、二回完全培地1ミリリットル中の組織を洗う。 NOTE：解離細胞を廃棄防ぐため、チューブから全培地を除去し、組織をピペット避ける。 </li><li> 1ミリリットル完全培地とトリットを追加ファイアーポリッシュガラスピペットで組織を尿酸。気泡の形成を回避し、単一細胞懸濁液が得られるまで粉砕する続ける。 注：通常、8-10が完全に解離のために必要とされる制限された先端を通過する。 </li><li>室温で5分間400×gで細胞を遠心し、培地を除去。 </li><li>再懸濁ゆっくりピによって完全培地1ミリリットル中にペレットを上下に4倍のために。 </li></ol> 4.メッキ腹側中脳細胞<ol><li> 90μlのトリパンブルー溶液を用いて細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を用いて細胞の数を数える。 注：細胞の生存率も、この段階で確認することができる。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿で​​滅菌マイクロ遠心チューブのキャップを置き、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたカバースリップを転送し、鉗子、キャップの上に一度に1を使用した。 注：カバースリップを洗浄しないでください、これはuneve原因となることがありますので、ラミニンを乾燥避けるn個の文化や細胞の生存性の減少。 </li><li> （ボリュームが流出せずにカバースリップの表面を覆うように最適である）完全培地を追加することによって、1μLあたり1500細胞に音量を調整し、各カバースリップの上に100μlの細胞懸濁液（150,000細胞の合計）を追加します。ペトリ皿を閉じて、加湿した組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で1時間、それらをインキュベートする。 NOTE：CRITICAL STEP：この手順は、細胞の付着および生存率を高めるために、胚あたりのカバースリップの数を増加させるために必要とされる。あるいは、細胞を（カバーガラスを含む）をウェルに直接転送することができるが、細胞の数は、（代わりに15万）ウェルあたり350,000増加させるべきである。直接転送が原因プレート（横またはカバースリップの下）に付着する細胞の約3-4カバースリップを生じながら、言い換えれば、この方法を使用して、8-10カバースリップを、取得することができる。平均viabiliこの方法を使用して培養物のtyが、約90％であった。 </li></ol> 5.文化成長および維持<ol><li>インキュベーションの1時間後に、慎重に400μlの予め温めた（37ºCに）完全培地を含む24ウェルプレートに培地を含むカバースリップを転送する（総容量：500μl）を。 37ºCで細胞のO / Nをインキュベートする。 </li><li>井戸のインキュベーション後24時間以内に、静かに各ウェルに500μlの完全培地を追加します。 注：最初の数時間は、ドーパミン作動性ニューロンの生存のための最も重要な段階で、生存細胞の数は、この点を越えて大きく変化しない。 </li><li>最初の2週間、または培地が黄色になるまで培養液に追加のメディアを追加しないでください。以上の2週間または新鮮な完全予め温めメディア（通常は隔週）と黄色、メディアの交換の半分（500μL）中〜色の変化のために培養した場合。 注：内のドーパミン作動性ニューロン培養物は、これらの条件下で6週間以上生存するであろう。 </li></ol>

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	<li>Prasad, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+immortalized+clonal+cell+lines+from+fetal+rat+mesencephalic+tissue.">Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).</li><li>Fall, C. P., Bennett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+time+course+of+MPP++-induced+apoptosis+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells.">Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).</li><li>Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modulation+of+dopamine+expression+in+neuronal+hybrid+cells+by+primary+cells+from+different+brain+regions.">Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).</li><li>Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+P75NTR+expression+causes+death+of+engrailed-deficient+midbrain+dopaminergic+neurons+by+Erk1/2+suppression.">Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression.</a> Neural Dev. 4, 11 (2009).</li><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain. 133, 2022-2031 (2010).</li><li>Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Parkinson's+disease.">Animal models of Parkinson's disease.</a> Bioessays. 24, 308-318 (2002).</li><li>Schober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classic+toxin-induced+animal+models+of+Parkinson's+disease:+6-OHDA+and+MPTP.">Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP.</a> Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).</li><li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+Parkinson's+disease+in+mice.">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).</li><li>Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesencephalic+type+1+astrocytes+rescue+dopaminergic+neurons+from+death+induced+by+serum+deprivation.">Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation.</a> J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+progressive+degeneration+of+nigral+dopaminergic+neurons+in+postnatal+Engrailed+mutant+mice.">Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice.</a> PNAS. 103, 15242-15247 (2006).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lifelong+maintenance+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+Nurr1+and+engrailed.">The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed.</a> J Biomed Sci. 21, 27 (2014).</li><li>Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons:+determination+of+their+developmental+fate+by+transcription+factors.">Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors.</a> Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).</li><li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+systems+in+the+brain:+an+update.">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li><li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease:+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms.">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aetiopathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection.">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li></ol>

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中脳ドーパミン作動性ニューロンは、中枢神経系におけるドーパミンの主な供給源である。これら3つのグループに分割され、黒質緻密部（SNpc）、腹側被蓋野（VTA）及びretrorubralフィールド（RRF）10、11。 SNpcとVTAのニューロンは、そのような感情、動機と運動行動の制御などの機能に関与する主要なドーパミン作動性経路に上昇、中間皮質、中脳辺縁系と黒質線条体を与える。 SNpcと?...

黒質のドーパミン作動性ニューロンの損失は、緻密は、パーキンソン病（PD）、第二の最も優勢な神経変性疾患の基本的運動症状につながる様部。この中脳ニューロン集団の終焉の根本的な原因は知られていない。開発を担当し、神経生理学的特性およびmesDAニューロンの生存を調節する生化学的経路を研究するために、いくつかの細胞培養と動物モデル系が使用されている。ラットは、ドーパミン作動性細胞株1RB 3 AN 27（N27）、ヒトドーパミン作動性の神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y、MN9Dおよびヒトの脳細胞をLUHMESマウスドーパミン作動性のハイブリッド細胞株を含む、不死化細胞株は、生化学的および限定された機構研究1のために使用されている-5。 mesDAニューロンの特定の損失の研究のために、いくつかの神経毒をベースと遺伝モデルが6-8を開発されてきた。初代腹側中脳の文化、ドーパミン作動性ニューロンの神経細胞とシナプスのプロパティと、この一般的な疾患の病因に関与する経路を研究するための不可欠なツールを提供する。 ここでは、より高い生存性と胚あたりのカバースリップの増加収量、結果の修正が含まれている中脳ドーパミン作動性ニューロンの分離のための詳細なプロトコルを提示する。前成熟したE12.5マウス中脳（ラットにおいてE14.5）の使用は、生存性を向上させます。この年齢でのニューロンは解剖時に無傷の細胞を残している、まだ軸索を開発し、それによって大幅に生存能力を高め、ストレスを最小限にしていない。また、腹側中脳の注意深い解剖は、このプロトコルのセクション2で説明したように、さらに生存性を高めます。胚あたりのカバースリップの数を増加させるために、代替的なメッキ法は、このプロトコルのセクション4に示されている。これは、下の4カバーガラスと比較して胚当たり最大10カバーガラスの収率をもたらす標準めっき条件は、このように、実験あたりの動物の量を減らす。 軸索とdentritesの文化展示成長におけるニューロンは、シナプス結合を形成し、生細胞イメージング、免疫細胞化学的および電気生理学的研究のために、これらの培養物は適して神経細胞とシナプスマーカーの存在を明らかにする。さらに、ニューロン培養の使用は遺伝的および薬理学的操作を容易にします。 in vitroでの 2日目からの神経突起の伸長が発生研究が可能になります。また、（6週間まで）培養物の長期生存は、これらのニューロンの遅い、進行性変性を研究するのに適したものとなる。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium nutrient mixture F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05% (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine, 0.01% solution</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Synapsin-1 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG&amp;nbsp;&amp;nbsp; antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase contrast microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip Forceps &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Two Dumont #45 Forceps &amp;ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic halogen illuminator</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m sterile filter units</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Petri dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

チロシンヒドロキシラーゼ（TH）に対する免疫組織化学は、培養中の細胞の0.5〜1％の間でドーパミン作動性であることを示しています。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）と微小管関連タンパク質2（MAP2）抗体（ 図3）を使用して、神経突起は、めっき後2時間以内に表示され、初日によって、軸索と樹状突起が区別できる（ 図2）である。ニューロンは、以上の6週間生?...

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Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K ビュー.  Imperial College London. The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

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Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

生物学

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

神経科学

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

 CNS相互作用研究のための一次ミクログリアとニューロン共培養プロトコール

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

著者スポットライト:疾患状態におけるミクログリアとニューロンの相互作用を研究するためのin vitro共培養モデル

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

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げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養