This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

הערה: בעלי החיים נשמרו ומטופל בעמידה בהנחיות מוסדיות ונהלי כל החיה אושרו על ידי צער בעלי החיים של אימפריאל קולג &#39;ובגוף סקירה אתית (AWERB) והמשרד לבית ולאוניברסיטה הרווארד מוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC), בעמידה בתקנות פדרליות ואת המדינה. 1. מגיב והתקנת הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה, aliquot ופתרון חנות 1 מ&quot;ג / מיליליטר Laminin ב -80 ºC. לפזר 2 μl ב 1 מיליליטר DMEM / F12, וכתוצאה מכך ריכוז ציפוי של 1-2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר. הערה: הפשירי Laminin לאט על קרח ולפזר בDMEM / F12 הקר ומייד להוסיף אותו לצלחות / coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 75 מיליליטר של 0.01% פולי-L-ornithine ב425 מיליליטר PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: חיי המדף של הפתרון הוא לעבוד עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 25% BSA ב PBS (wt / כרך), pH 7.4, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד year. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% FBS (בHBSS) תקשורת שחרור משרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מלא על ידי הוספת 50 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין, תוספת 1x N2, 5% (כרך / כרך) FBS, 0.36% D - (+) - גלוקוז (wt / כרך), BSA 0.25% (wt / כרך) ל DMEM / F12 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: חיי המדף הוא עד 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מקום ברותח אתנול 70% (כרך / כרך) במשך לפחות 30 דקות כדי להסיר כל עקבות של שומן וחיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips המקום בצלחות 24 גם ולהוסיף פתרון 500 μl פולי-L-ornithine היטב כל אחד. דגירה שעה 1 מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT ולאחר מכן, לשטוף 3 פעמים עם 500 מים μl. הוסף פתרון laminin 500 μl לכל צלחת ודגירת O / N בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס. הערה: למרות שאין שוטף נחוץ לאחר טיפול laminin, שטיפה פחות משלוש פעמים תוצאות poly-L-ornithine במוות של התאים 24 שעות לאחר culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולני הטיפים של טפטפות זכוכית על גז טבעי או f לפידצולע. הערה: לאחר שלב זה הקוטר של הקצה צריך להיות כמחצית מגודלו הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הכובעים של 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, באמצעות מספריים וחיטוי autoclaved. </li></ol> 2. Dissection של עוברי הגחון מוח תיכון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכרים לְהַרְדִים בעתו בהריון (E12.5) משאיפת CO 2 ולאחר מכן להרדים נקע בצוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הבטן עם אתנול 70% ולעשות חתך בבטן עד שקי רחם כל חשופים. שימוש במלקחיים לחתוך את הקובץ המצורף בנרתיק ולהסיר רחם. מניחים את הרחם בHBSS קר כקרח, בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים מן הרחם והשק מי שפיר, באמצעות מלקחיים (איור 1 ג). עוברי מקום בHBSS קר כקרח טרי. הערה: המלבן ב1D איור מציין את מיקומו של המוח התיכון הגחון העוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתיחה (הגדלה 10x) ולנתח את mesencephalicקשת על ידי חיתוך במוח במצר ובאזור גבול mesencephalic-diencephalic, באמצעות bioscissor ומלקחיים (איור 1E, עיין באיור 1 א לקווים של חתך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלקח את כל המוח התיכון, לעשות חתך במוח התיכון mediodorsal (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קרומי המוח, תוך שימוש בשני מלקחיים (איור 1H). הערה: שלב קריטי: צעד זה הוא חיוני לתשואה עצבית אופטימלית והישרדות. מאז תנאי התרבות הם אופטימליים לתאי מוח, רוב התאים מהרקמות המקיפות למות לאחר ציפוי והאות אפופטוטיים מהרקמה זו עלולה לגרום נזק לשלמות של התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטח את רקמת המוח התיכון בצלחת פטרי להתבונן בצורת הפרפר ולחתוך כמחצית מכל כנף, באמצעות סכין גילוח מעוקר (איור 1H, I). הערה: איור 1J מתאר את המוח התיכון הגחון המבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אתחתיכת המוח התיכון הגחון לתוך HBSS קר כקרח בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהמשיך בעובר הבא. הערה: שלבי 2.1-2.8 לא צריכים לקחת יותר משעה 1. שמירה על העוברים מעבר למסגרת זמן זו על קרח יורדת כדאיות תא באופן משמעותי. </li></ol> 3. דיסוציאציה של תאי המוח תיכונים הגחון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החתיכות של המוח התיכון הגחון מתחת לזרימה למינרית. הסר את HBSS ולהוסיף 1 מיליליטר מחומם מראש (37 ºC) 0.05% טריפסין-EDTA לתוך צינור חרוטי (כרכים מספיק לתקופה של עד 12 חתיכות של המוח התיכון הגחון). דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר טריפסין-EDTA מתחת למכסה המנוע ולהוסיף בינוני דה-הפעלת 1 מיליליטר (הסרום יהיה לבטל טריפסין) לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום שחרור משרות ולשטוף את הרקמה ב 1 מיליליטר בינוני מלא פעמיים. הערה: יש להימנע מהסרה כל המדיום מהצינור וpipetting הרקמות, כדי למנוע השלכת התאים ניתקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני מלא 1ml וטריטurate הרקמה עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש. למנוע היווצרות של בועות ולהמשיך triturating עד השעיה תא בודדת מושגת. הערה: בדרך כלל, 8-10 עוברים בקצה המוגבל נדרשים לניתוק מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות בRT ולהסיר את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר בינוני מלא על ידי pipetting לאט מעלה ומטה עד ארבע פעמים. </li></ol> 4. תאי ציפוי הגחון המוח תיכונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 μl של ההשעיה התא עם פתרון כחול 90 μl Trypan ולספור את מספר התאים עם hemocytometer. הערה: ליכולת הקיום של התאים גם ניתן לבדוק בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כובעי צינור microcentrifuge מעוקרים ב100 מ&quot;מ צלחות פטרי ולהעביר את coverslips פולי-L-ornithine / Laminin המצופה, באמצעות מלקחיים, אחד בכל פעם בחלק העליון של הכובעים. הערה: אין לשטוף את coverslips ולמנוע התייבשות laminin, שכן הדבר עלול לגרום לuneveתרבויות n וירידה בשרידות של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את עוצמת הקול ל1,500 תאים לכל 1 μl על ידי הוספה בינונית מלא ולהוסיף 100 μl (כולל של 150,000 תאים) של ההשעיה התא על גבי כל coverslip (נפח אופטימלי כדי לכסות את פני השטח של coverslip ללא שפיכה). סגור את צלחות פטרי דגירה אותם במשך שעה 1 בתרבית רקמת חממת humidified (37 ° C, 5% CO 2). הערה: שלב קריטי: צעד זה נדרש לשיפור ההתקשרות ויכולת הקיום של התאים ולהגדלת מספר coverslips לעובר. לחלופין, ניתן להעביר את התאים ישירות לתוך הבארות (coverslips מכיל) אבל מספר התאים צריך להיות מוגבר ל350,000 לכל טוב (במקום 150,000). במילים אחרות, שימוש בשיטה זו, ניתן לרכוש 8-10 coverslips, תוך העברה ישירה מניבה כ 3-4 coverslips בגלל התאים, אשר לצרף לצלחות (לצד או מתחת לcoverslips). Viabili הממוצעty של התרבויות, שימוש בשיטה זו היה כ -90%. </li></ol> 5. תרבות צמיחה ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של דגירה, להעביר בזהירות את coverslips כולל הבינוני לתוך צלחות 24 גם, המכיל בינוני מחומם מראש (עד 37 מעלות צלזיוס) מלא 400 μl (נפח כולל: 500 μl). דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך 24 שעות לאחר הדגירה של הבארות, בעדינות להוסיף בינוני שלם 500 μl לכל אחד. הערה: כמה השעות הראשונות היא השלב הקריטי ביותר להישרדות של נוירונים דופאמין ואת מספר התאים ששרדו אינו משנה באופן משמעותי מעבר לנקודה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תוסיף מדיה נוספת לתרבויות בשבועיים הראשונים או עד הבינוני הופך להיות צהוב. אם culturing במשך יותר משבועיים או בינוניים שינויי צבע למחצית חליפין של התקשורת (μl 500) הצהוב, עם תקשורת מלאה טרי מחוממת מראש (בדרך כלל כל שבועיים). הערה: נוירונים דופאמין בתרבויות תשרודנה במשך יותר מ -6 שבועות בתנאים אלה. </li></ol>

<ol>
	<li>Prasad, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+immortalized+clonal+cell+lines+from+fetal+rat+mesencephalic+tissue.">Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).</li><li>Fall, C. P., Bennett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+time+course+of+MPP++-induced+apoptosis+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells.">Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).</li><li>Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modulation+of+dopamine+expression+in+neuronal+hybrid+cells+by+primary+cells+from+different+brain+regions.">Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).</li><li>Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+P75NTR+expression+causes+death+of+engrailed-deficient+midbrain+dopaminergic+neurons+by+Erk1/2+suppression.">Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression.</a> Neural Dev. 4, 11 (2009).</li><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain. 133, 2022-2031 (2010).</li><li>Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Parkinson's+disease.">Animal models of Parkinson's disease.</a> Bioessays. 24, 308-318 (2002).</li><li>Schober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classic+toxin-induced+animal+models+of+Parkinson's+disease:+6-OHDA+and+MPTP.">Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP.</a> Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).</li><li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+Parkinson's+disease+in+mice.">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).</li><li>Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesencephalic+type+1+astrocytes+rescue+dopaminergic+neurons+from+death+induced+by+serum+deprivation.">Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation.</a> J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+progressive+degeneration+of+nigral+dopaminergic+neurons+in+postnatal+Engrailed+mutant+mice.">Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice.</a> PNAS. 103, 15242-15247 (2006).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lifelong+maintenance+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+Nurr1+and+engrailed.">The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed.</a> J Biomed Sci. 21, 27 (2014).</li><li>Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons:+determination+of+their+developmental+fate+by+transcription+factors.">Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors.</a> Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).</li><li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+systems+in+the+brain:+an+update.">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li><li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+mechanisms+and+models.">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li><li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease:+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms.">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aetiopathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection.">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li></ol>

No conflict of interest declared.

נוירונים דופאמין במוח תיכון הם המקור העיקרי של דופמין במערכת העצבים המרכזית. הם חולקו לשלוש קבוצות, compacta סעיפי nigra substantia (SNpc), אזור הגחון tegmental (VTA) ושדה retrorubral (RRF) 10, 11. הנוירונים בSNpc וVTA להצמיח מסלולים עיקריים דופאמין, mesocortical, mesolimbic וNigro-striatal, מעורבים בפונקציות כגון...

הפסד של נוירונים דופאמין מnigra substantia pars compacta מוביל לתסמינים מוטוריים העיקרי של מחלת פרקינסון (PD), ההפרעה ניוונית של מערכת עצבים הנפוצה ביותר השנייה. הסיבה הבסיסית של פטירתו של אוכלוסייה העצבית mesencephalic זה אינה ידועה. כדי לחקור את התהליכים הביוכימיים אחראים על הפיתוח וויסות נכסים והישרדות של תאי עצב mesDA, כמה תרבית תאים ומערכות מודל החיה neurophysiological היה בשימוש. שורות תאים הנציחו, כולל 1RB דופאמין עכברוש קו תא 3 27 (N27), שורת תאי נוירובלסטומה דופאמין אדם SH-SY5Y, שורת התאים היברידיים דופאמין העכבר MN9D וmesencephalic אדם LUHMES תאים היו בשימוש במשך מחקרים מכניסטית ביוכימיים ומוגבלים 1 -5. לצורך המחקר של האובדן הספציפי של נוירונים mesDA, כמה עצבים מבוססי ומודלים גנטיים פותחו 6-8. תרבויות המוח התיכון הגחון ראשיות, מספק כלי הכרחי ללימוד התכונות עצביות והסינפטי של נוירונים דופאמין והמסלולים מעורבים בפתוגנזה של הפרעה שכיחה זו. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד של נוירונים דופאמין mesencephalic, המכיל שינויים וכתוצאה מכך שרידות גבוהות יותר ותשואה מוגברת של coverslips לעובר. שימוש בmesencephalon טרום בוגרים עכבר E12.5 (E14.5 בחולדה) משפר שרידות. בגיל זה הנוירונים לא פיתחו האקסונים עדיין, מה שמשאיר תאים שלמים במהלך נתיחה וממזער את הלחץ ובכך להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות. בנוסף, לנתיחה זהירה של המוח התיכון הגחון, כפי שתוארו בסעיף 2 לפרוטוקול זה, משפרת עוד יותר את השרידות. כדי להגדיל את המספרים של coverslips לעובר, שיטת ציפוי חלופית מוצגת בסעיף 4 לפרוטוקול זה. זה מוביל לתשואה של עד 10 coverslips לכל עובר לעומת 4 coverslips תחתתנאי ציפוי סטנדרטיים ובכך להקטין את כמות בעלי חיים לכל ניסוי. הנוירונים בתולדת תערוכת תרבות של אקסונים וdentrites, יוצרים קשרים סינפטיים ולחשוף את הנוכחות של סמנים עצביים והסינפטי עושים תרבויות אלה מתאימים להדמיה לחיות תא, immunocytochemical ומחקרי אלקטרו. יתר על כן, השימוש בתרבויות עצביות מאפשרת מניפולציה גנטית ותרופתית. תולדה של neurites מיום 2 במבחנה מאפשרת למחקרים התפתחותיים. יתר על כן, ההישרדות לטווח הארוך של תרבויות (עד שישה שבועות) הופכת אותם מתאימה למחקר של הניוון האיטי, ההדרגתי של תאי העצב האלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="721">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle medium nutrient mixture F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020-117)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement (100X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% (wt/vol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>P60101-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-ornithine, 0.01% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Synapsin-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1543P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG&#160;&#160; antibody</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG&#160;&#160; antibody</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG&#160;&#160; antibody</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG&#160;&#160; antibody</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG&#160;&#160; antibody</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)</td>
			<td>Biowhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>May-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Slip Forceps &#8211; Dumoxel</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11251-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two Dumont #45 Forceps &#8211; Dumoxel</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11245-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Iris Scissors - Straight 11.5cm</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic halogen illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MKII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td>Proscitech</td>
			<td>SVZ2NIOU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m sterile filter units</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NL-CE-156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100x20mm Petri dishes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>1943-10012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (ה &#39;) עולה כי בין 0.5-1% מהתאים בתרבית הם דופאמין. תחזיות עצביות מופיעות בתוך 2 שעות לאחר ציפוי ועל ידי ביום הראשון, אקסונים ודנדריטים ניתן להבחין (איור 2), באמצעות טירוזין hydroxylase (TH) ונוגדני microtubule הקשורים חלבון 2 (MAP2) (איור ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains at JoVE.com

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

isolation-culture-long-term-maintenance-primary-mesencephalic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Imperial College London. The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Video: Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...