We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

蛍光タンパク質キメラの1の生成と検証<ol><li>標準的な組換えDNA戦略13を用いて目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に緑色蛍光タンパク質（GFP）を追加。 注：我々は広範囲にGFPを用いているが、このようなシアン蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）などの他の変異体は、DsRedのとmCherryを用いることができる。フォアフォールディング効率、明るさと光安定性の改善は、絶えず行われている、と研究者らは、最新世代の構築物の彼ら自身を利用すべき。 <ol><li>正しいDNA配列を確認し、GFP部分は、目的のタンパク質とインフレームであることを確認してください。標準的な組換えDNA戦略21を使用してシークエンシングを行います。 注：多くの機関は、調査員が、追加情報のために連絡することが奨励されているコアDNA施設を、持っている。 </li><li>シングルまたはダブルパス膜タンパク質生成融合タンパク質19のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方のバージョン。 </li><li>マルチ貫通タンパク質の推定膜外ループ内のGFPのほか、末端を挿入します。タンパク質は、ERトランスロコンを通過した後の信号系列は、しばしば、タンパク質分解によって切断されるように、標的タンパク質のアミノ末端に結合した蛍光融合タンパク質を有する膜貫通キメラを生成する際に特別な注意を払う。 </li><li>インタクトなアミノ末端タグ付き蛍光タンパク質を含む成熟タンパク質を生成するために、現存のシグナル配列の場合には、切断部位の蛍光融合タンパク質先端を挿入。キメラ21を生成するための標準的な組換えDNA戦略を採用する。 </li></ol></li><li>関心の細胞株で十分適切にローカライズされた蛍光シグナルの存在を決定する。 <ol><li> appropriの下でGFPの固有の蛍光を用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞を観察するフィルタ設定された条件を食べました。 510から560 nmのを包含するGFPフィルターセットの場合、正しいフィルターを採用フォアのために使用されていることを確認。 注：目で評価は信号が存在する中で細胞構造を簡単に背景の上に解決されていることを十分に強い信号を提供する際に十分な信号が達成される。さらに、GFPタンパク質の染色パターンは、適切な細胞小器官のマーカーのそれと一致し、ネイティブのタグなしタンパク質のものと好ましくは同一である必要があります。 </li></ol></li><li>安定または一過性トランスフェクションアプローチが評価されているタンパク質に基づいて利用されるかどうかを決定します。 注：安定なトランスは、一般的に一過性のシステムよりも低レベルの発現を与える。一過性発現は、タンパク質の高レベルの発現を生じ、信号強度（タンパク質依存〜5-24時間後にトランスフェクション）を増加させるが、それはまた、タンパク質AGGRとして過剰発現アーチファクトにつながる可能性誤った細胞内局在につながる経路を標的にタンパク質のegationや彩度。 </li></ol>細胞および細胞培養の2トランスフェクション注：種々の細胞が14 HEK293、HeLa細胞、COS-7およびCHO細胞を含む、FPP分析に適している。以下の説明は、Hek293細胞での膜タンパク質の発現に基づいている。 <ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37℃で250 / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、6mlの中の付着単層として、ヒト胚性腎細胞（HEK293）を成長さ5％CO 2 C。層流の組織培養フード内のセルのすべての作業を行う。 T-75フラスコ中〜80％コンフルエントになるまで培養液中で細胞を増殖させる。 </li><li> transienを生成するために、脂質を含む、任意の標準的な高効率、低毒性のトランスフェクション法、ウイルス - またはエレクトロポレーションベースの技術を使用して、トランスフェクト細胞Tまたは安定発現。通常、1×10 6細胞あたりのプラスミドDNA2μgの良い再現性のあるタンパク質の発現を提供します。 CO 2が可能な組織培養インキュベーターにおいて37℃で適切な組織培養培地で5-48時間、細胞を維持する。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、適切なフィルターセットを用いて、GFPの固有の蛍光シグナルを使用して、落射蛍光顕微鏡を用いてGFP融合タンパク質の発現のために細胞をモニターする。蛍光シグナルは通常、トランスフェクション後24〜72時間以内に最大値に達する。蛍光信号が最大レベルに達したときに細胞を使用する。目的のタンパク質またはGFP部分のいずれかに対する抗体を用いたイムノブロット分析によってタンパク質発現レベルをモニターする。 </li><li>コー​​ティングされたカバースリップ上の実験解析プレート細胞について。どちら生細胞構成または以下の固定の下に表示し、顕微鏡スライド上にマウントします。プレートの細胞が24-48時間以内に60％-80％のコンフルエンスを達成するために。 <ol><li>全面を覆うようにポリリジン溶液（0.1 mg / ml）で、でコーティングしたカバー。 37℃で細胞培養インキュベーター中で60分間、続いて室温で紫外光下で30分間、インキュベートする。過剰ポリリジンを削除し、PBS中でカバーグラスを3回すすいでください。 </li><li>あるいは、油浸対物レンズとの直接撮像を可能にする光学ガラス底細胞培養プレートからなるチャンバーカバーグラス上に細胞をプレー。実際の顕微鏡のセットアップは研究者に利用可能な機器に依存しますが、迅速なソリューションの変更が可能であるべきである。細胞型および細胞の形状に応じて、細胞は、FPPアッセイの時点で約60〜90％コンフルエントであるべきである。 </li></ol></li></ol> 3.蛍光顕微鏡のセットアップ<ol><li>そのような60X、1.42 NA油浸対物レンズとして最大のシグナル収集および空間分解能、用の高開口数（NA）油浸対物レンズを使用してください。目を使用してください蛍光団を刺激するE以下のレーザー：アルゴンガスを488nm（GFP及びYFP）と561ダイオード（RFP、mCherryを）。 </li><li>各構築物のための画像の最適な露出、ゲイン、キャプチャレートを決定する。 （ステップ7.1.2を参照）を光退色最小限にするためにレーザー強度と露光時間を調整します。 </li><li>複数のフルオロフォア（ 例えば 、膜タンパク質マーカーと協調膜透過のための可溶性マーカー）を用いた研究のために、信号のクロストークを最小限にし、信号対雑音比を最大にするために適切なフィルターセットを選択する。 </li></ol> 4.細胞膜透過化のための最適条件を確立する<ol><li> （ 例えば EGFP、DsRedの）唯一の可溶性の蛍光タンパク質を発現する細胞からの細胞培養培地を除去します。 KHM緩衝液（110 mMの酢酸カリウム、3mMのMgCl 2を 、20mMのHEPES-NaOHでpH7.2）中で細胞を3回（各1分）で洗浄する。室温で細胞およびすべての試薬を用いた実験を行います。 </li><li>場所細胞Onはカバーガラスは、蛍光顕微鏡ステージ上KHMバッファー（ステップ2.4​​参照）、コントロールの非透過化」段階を表す第一の画像を収集する。 </li><li>選択的に、原形質膜を透過性にするために、細胞にKHMバッファにジギトニン（30μM）を加える。 10-60秒間5ml /分の速度で、バッファ（バッファ+ジギトニン）で細胞を灌流。 </li><li>徐々にジギトニンの濃度を高めることにより、最適なジギトニン濃度を決定します。ジギトニンアプリケーションの10~60秒以内可溶性EGFPからの蛍光シグナルの完全な損失がある場合に最適なジギトニン濃度が達成される。多くの細胞については10〜50μMのジギトニンの適用は、細胞膜を透過するのに十分である。 <ol><li>すべてのアプリケーションがジギトニンの可能な限り低い濃度を使用してください。透過化バックグラウンド信号のための透過処理をジギトニン後の画像を収集します。 </li></ol></li><li>関心のGFP-タンパク質キメラが内膜であることを確認してください原形質膜16のジギトニン透過化以下の蛍光シグナルの細胞の保持を確認することによりtegrated。 <ol><li>オルガネラ特異的蛍光タンパク質23を発現する。ミトコンドリアタンパク質は、 例えばこの点16、、pDsRed2-水戸ベクターにうまく機能します。ステップ2.1で説明したように最適な発現条件を決定する。 </li><li>ジギトニン濃度が長期化にわたって細胞内小器官の形態は（60分まで）ジギトニンへの暴露一定のままであることを保証することによって、使用される細胞タイプに適切であることを確認します。 注：そのようなリソソームなどの様々な細胞コンパートメント、に対する抗体を用いて使用する標準免疫蛍光顕微鏡プロトコル（ 例えば 、LAMP1）、ゴルジ（ 例えば 、TGN38）、小胞体（ 例えば 、カルネキシン）、エンドソーム（ 例えば 、Rab5の）、ミトコンドリア（ 例えば 、チトクロームc）の細胞内小器官の形態/整合性は飛躍的にオベ変更された場合rは60分には、ジギトニン濃度が高すぎる可能性があり、及びジギトニンの濃度および/または露光時間の減少を必要とする。 注：ジギトニンは吸入および皮膚接触による有毒である。適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。 </li></ol></li></ol>蛍光タンパク質の5プロテアーゼトリートメント<ol><li> KHMバッファに細胞を洗浄した後、プロテアーゼ（プロテイナーゼK、KHMバッファ中に50μg/ mlの）を追加し、直接細胞に。連続的に製造が風呂重力供給灌流システムを用いて5ml /分の流量で細胞を灌流する。 <ol><li> 50ミリリットル注射器に保管してソリューションとポリエチレン管を浴（5ミリリットル/分の流量）で、単一の出口でマニホールドに独立したリザーバを接続。定数（0.5 ml）を、浴容量を維持し、手動で灌流リザーバとを切り替えて溶液交換を達成するために、位置吸引ピペット。 </li></ol></li><li>フッ素かどうかを判断するために画像を収集escent信号が持続するか、低下します。 30〜60秒を超える初期信号強度の&gt; 90％の損失がGFPタンパク質キメラのタンパク質分解と一致している（代表的な結果を参照）。 </li><li>無信号劣化がプロテイナーゼKで観察されていない場合、そのような損失が予想される場合、KHM緩衝液中のトリプシン（4-8 mM）を有するプロテイナーゼK溶液を置き換える。必要に応じて、プロテイナーゼK、トリプシンの混合物を利用する。プロテアーゼ活性をクエンチする必要はない。 </li></ol>外部ドメインとプラズマ膜タンパク質6.別のアプローチ<ol><li>細胞膜のタンパク質について、透過処理をジギトニン前に外部の蛍光タンパク質キメラのためのアッセイを行う。 KHM緩衝液中のカバースリップ上の細胞（5 ml /分×3分間）洗浄し、そしてプレプロテアーゼ治療のための画像を取得し、ステップ7のようにプレプロテアーゼ蛍光シグナルを定量化する。 </li><li>トンで、（KHMバッファ中に50μg/ mlまたはトリプシン4-8 mMのプロテイナーゼK）をプロテアーゼ細胞を公開KHM培地を含むプロテアーゼ（流速5ml /分）で細胞を灌流することによりジギトニン彼が不在。信号が消えるどのように迅速または信号が持続する時間を決定するために、蛍光タンパク質の画像を収集。 </li><li>ジギトニン透過化の前に、10％血清（FBS）を含有する細胞培養培地中で細胞を3回（各1分）で洗浄することにより、すべてのプロテアーゼ活性をクエンチする。 </li><li> 2分間KHM緩衝液（5ml /分の流量）で灌流して細胞を洗浄する。前の透過化画像を取得。ステップ4で説明したように細胞膜を透過。 </li><li>手順5で説明したようにプロテアーゼを添加した後の画像を収集します。 </li></ol> 7.画像解析<ol><li>蛍光シグナルの損失がリアルタイムでモニターすることができる「生細胞」記録が可能な倒立顕微鏡を使用する。継続的なモニタリングのために、同一のパラメータ（露光時間、ゲイン、レーザ強度など ） を採用する。 <ol><li> EXPERを決定対照条件下で、目的のGFPタンパク質からの蛍光シグナルを観察することによりimentalパラメータ（ すなわち 、KBHは緩衝液単独）。 10〜20分間かけて信号強度の感知できる損失がないことを保証するためにコンピュータ駆動顕微鏡ゲイン、レーザ強度​​及び露光時間の設定を調整する。 注：信号強度は、絶対値ではなく、顕微鏡システムと各PIに対する利用可能な設定に基づいている。相対的な蛍光強度の変化を監視する。 </li></ol></li><li>また、プロテアーゼが続くジギトニンでの設定の時点で細胞を処理し、事前のイメージングのためのカバーガラスに取り付けるに細胞を固定。ジギトニンまたはプロテアーゼの0、30、60、120と300秒後添加で開始し、経験的に初期調査のためのステップ4と5の手順を以下の時点を決定します。 <ol><li>細胞（室温で20分）で完全に目を沈めるために十分な量の固定液（PBS中の3.7％パラホルムアルデヒド）を用いて固定する電子セル。 </li><li> PBSは、20 mMグリシン（3×5分）を含有する細胞をすすぐことによって、残留ホルムアルデヒドを急冷。 </li><li>カバーガラスから余分な液体を除去し、ガラス顕微鏡で50μlの取り付けメディアにカバースリップを反転させることによってマウントカバースリップは、撮影のためにスライドします。スライドを画像化する前に一晩乾燥することができます。 </li></ol></li><li>コンピューター制御蛍光顕微鏡でビデオ画像キャプチャ機能を使用して（適切なフィルタの下で使用されるフ​​ルオロフォアと互換設定）の蛍光顕微鏡画像を収集する。 </li><li>インキュベーション条件の関数としての蛍光シグナル強度を定量化する。個々のセルを囲む関心領域内の平均ピクセル強度（ROI）を取得します。 </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

膜タンパク質の正しい配向及びトポロジーは、その適切な機能のために不可欠である。膜タンパク質トポロジーを理解することの重要性にもかかわらず、そのようなデータが完全に欠けている多くのタンパク質が存在する。 FPPは、簡単かつ効率的な膜タンパク質のトポロジを決定する方法であり、最も研究室で行うことができるものを提供する。 FPPのアプローチは、タンパク質のトポロジ?...

形質膜、ならびに多数の細胞内膜二水性区画を分離する障壁として機能する。原形質膜の場合には、分離は、外部との間で、セルの内部にある。細胞内小器官のためには、細胞質および細胞小器官の内腔の間である。例えば、小胞体（ER）膜は、環境1を減少させる、サイトゾルからERのルーメン内酸化環境を分離する。膜タンパク質は、ER関連リボソーム上で合成され、ER膜2内の最終的なトポロジを達成している。タンパク質のための適切な膜配向とトポロジの買収は、彼らの正常な機能のために重要である。正しいトポロジーは、膜タンパク質の関連ドメインは、その結合パートナーと相互作用することができ、それは重要な翻訳後修飾が起こることができ、そして原形質膜タンパク質の場合、細胞と相互作用し、tは対応することができその環境をoを完全膜タンパク質の機能を理解するために、そのタンパク質は、それが含まれている膜、 すなわち 、その膜トポロジーに対して配向されているかを知ることが明らかに必須である。基本的な科学的知識の獲得に加えて、膜タンパク質のトポロジーを理解し、そのタンパク質表面の態様は異なる環境にさらされている膜タンパク質の薬理学的標的3の大部分を構成するので、臨床的意味をマークした。最近まで、時間とお金にかなりの投資を必要としていたか、手に入れるのが困難な試薬を必要とした膜タンパク質のトポロジーを決定することに近づく。 両方の実験とin silicoでのアプローチは、原形質膜内に存在するタンパク質の膜トポロジーを決定するために使用されてきた。 INDIVIの評価を疎水性に基づく膜貫通ドメインの最初の予測ので、デュアルアミノ酸3、多数の予測アルゴリズムは、インターネット上で現在利用可能であり、単に、タンパク質のアミノ酸配列の知識を必要とする。しかし、仮定は、多くの場合、そのようなモデリングプログラム、トポロジー4,5の不正確な割り当てにつながる可能性の仮定の中心である。これらのコンピュータベースの予測が暫定的に膜貫通領域を割り当てることができますしながら、また、彼らは常に、アミノまたはタンパク質のカルボキシ末端は細胞小器官内腔または細胞外装、細胞質内にあるかどうかを判断しないでください。計算能力を増加させ、さらにはと機械学習アルゴリズム6、そのようなデータの使用は、まだモデルであり、実験的に取得したデータを使用して検証する必要があります。膜トポロジーの直接の実験的決定は、その免疫反応性の評価は、細胞透過処理の前と後に行われているタンパク質、全体に分散既知のエピトープを有するモノクローナル抗体のパネルを使用して行われている。このアプローチは、目的のタンパク質のために利用できない場合があり、抗体のセットを必要とする。 別の戦略は、再び膜透過化の前と後の免疫反応性の決定に続いて、タンパク質の様々な場所にかかるのmycまたは赤血球凝集素（HA）などのエピトープタグを操作することである。免疫原性タグ、酵素タグ（アルカリホスファターゼを含む、βガラクトシダーゼ、またはβラクタマーゼ）に加えて、そのようなシステインスキャニングのような化学修飾は、すべての膜タンパク質トポロジー7,8を決定するために使用されてきた。原形質膜タンパク質のトポロジーマッピングのために使用するさらなる方法は、エピトープタグにわずかに異なるアプローチに依存している。この方法において、タグ配列は、N結合型グリコシル化コンセンサス配列NXS / Tである。そのような配列は、生合成経路のルーメン内に存在する場合、グリコシル化は、対管腔におけるタグの存在、発生するので細胞質ゾル区画に容易SDS-PAGEゲル上の質量シフトとして観察される。このようなアプローチは、multispanningイオンチャネルCFTR 9に適用されている。これらのすべてのアプローチが利用されてきたが、それらはすべてマニホールド構築物を作製し、配列決定するために分子生物学においてかなりの投資を必要とすることは明らかである。 細胞内小器官内に配置された膜貫通タンパク質に関するトポロジ情報を調べるには、より挑戦的であることが判明した。蛍光ベースの技術の適用は、しかしながら、多くの単純な膜トポロジーの決定をした。二分子蛍光相補性（BIFC）の技術がそのタンパク質10の蛍光特性を復元する、蛍光タンパク質の二つの非蛍光フラグメントとの相互作用に依存しています。最初に、生体内 10 でのタンパク質-タンパク質相互作用を決定するために説明したが、このアプローチは、利用されている植物細胞11内の膜タンパク質のトポロジーを決定する。しかし、このアプローチは、目的のタンパク質だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官の管腔を標的とする種々の融合タンパク質との融合タンパク質だけでなく生成を必要とする時間集約的でもあり、関心が常駐の細胞内タンパク質をメンブレンそれらの知識を必要とする。 膜タンパク質のトポロジーを決定する代わりに単純なアプローチは、12に記載されている。アッセイ、蛍光プロテアーゼ保護（FPP）は、GFPと目的の遺伝子との間の融合タンパク質の生成を必要とします。アプローチは、GFP部分への非特異的プロテアーゼの相対的なアクセス可能性に基づいている。 GFPは、細胞内小器官の内腔に存在することにより、タンパク質分解から保護されているか、細胞質ゾル中に存在することにより、タンパク質分解にさらされているかどうかに応じ。目的のタンパク質にGFP部分は細胞質に面している場合このように、それはにさらされるプロテアーゼ活性および蛍光シグナルが失わ。目的のタンパク質にGFP部分は（そのようなゴルジ内腔など）プロテアーゼから「保護された「環境に直面している場合には逆に、その後蛍光シグナルが持続します。 プロテアーゼが細胞に侵入することができますが、コレステロール結合薬物ジギトニンが使用されている細胞内膜コンパートメントを入力しないでください。コレステロールは、脊椎動物における支配的なステロールであり、具体的には細胞内区画に対する原形質膜に富んでいる。グリコシド毒素は、ジギトニンは、植物ジギタリスプレアから抽出される。ジギトニンは、選択膜permeabiliztion 14,16（ 図1）に導くコレステロールリッチな膜に対する親和性を有する。小さな細胞質ゾル成分の排出を可能にすることに加えて、ジギトニン透過化はまた、プロテイナーゼKまたはトリプシンなどの外因性分子の侵入を可能にする。 FPPプロトコルは、FACを利用しています原形質膜は、細胞コレステロール17の80％まで含んでtは、そのような非常に低いコレステロール含有量を有し、ER、ゴルジ体、エンドソーム、ミトコンドリアなどの他の細胞小器官、一方、無傷のままである14。原形質膜へのコレステロールの選択的な取り込みは、Sのような多様な真核生物種においてジギトニン依存性血漿膜透過の使用を可能にする、多くの真核細胞において観察されている人間14,18に出芽酵母 。 FPPアッセイは、（a）は、タンパク質が膜結合/または関連する細胞質ゾルおよび膜タンパク質の（b）の領域で自由に拡散可能であるかどうか、サイトゾルまたは細胞小器官の内腔に面する決定する、簡単、迅速、かなり強固な手段を提供する。膜タンパク質は、複数の方向を持っている必要があり、信号が支配的なフォームから生じることになるとマイナー形式は検出されません。関心上のタンパク質にGFP部分の付加は、その機能に影響を与え得るという懸念があり得るしながら/または細胞内局在、これは実際よりも実際はより理論的です。実際、多くの研究は、GFPタグがタンパク質19,20の特性を変更しないことを示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

細胞膜透過処理 効率的な形質膜透過化は、可溶性の蛍光タンパク質（ 例えば 、GFP、DsRedを）する（ステップ4）を用いて決定される。これらのタンパク質は、細胞内で発現された場合、細胞質ゾル中で自由に拡散しており、原形質膜が（ 図2）を用いてジギトニン透過処理されたときに失われる。蛍光シグナルの完全な消失は、ジギトニンアプ?...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K ビュー.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

生物学

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.