蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

SECプロファイルは、タンパク質の品質を分析するための強力な方法です。目標は、蛍光を使用して膜タンパク質のSECプロファイルを収集し、サンプルの品質を通知することです。FSECは少量のサンプルを使用し、精製のために実行でき、比較的簡単で、多くのラボで利用可能な機器で実行できます。

手順を実演するのは、ピークプロテインのシニアプロテインサイエンティストであるジャックライトです。まず、マイナス80°Cで保存したセルパレットを室温で15分間、またはサンプルが凍結しなくなるまで解凍して、セルパレットを調製します。サンプルをすぐに氷に移します。

サンプルを再懸濁して可溶化するには、2ミリリットルの可溶化バッファーをセルパレットに追加します。摂氏4度で15〜30分間、エンドオーバーエンド反転でインキュベートします。次に、事前に混合した洗剤ストックを追加して、最終濃度1%ドデシルマルトシド(DDM)と0.1%コレステロールヘミコハク酸塩(CHS)にします。

摂氏4度でエンドオーバーエンド反転で30分間可溶化します。低速遠心分離工程を行うには、スイングアウトバケットを使用してベンチトップ遠心分離機でサンプルを遠心分離し、2000gで15分間遠心分離します。その後、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた鈍端針を用いて、低速遠心分離から超遠心チューブに上清を移し、高速遠心分離を行う。

パレットを乱さないようにしてください。チューブのペアのバランスをとった後、それらを固定角度の超遠心分離ローターに入れ、摂氏4度で250, 000gで30分間遠心分離します。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)にサイズ排除クロマトグラフィー(SECバッファー)を充填し、ポンプの空気をパージして調製します。

SECカラムをFPLCに接続し、カラムに空気が入らないようにします。SECカラムを1.5倍容量のラボグレードの蒸留水およびろ過水で洗浄し、続いてカラムに推奨される流量と圧力で1.5倍容量のSECバッファーで洗浄することにより、SECカラムを事前平衡化します。SEC実験を実行するには、シリンジに取り付けられた鈍端針を使用して、高速遠心分離ステップから1ミリリットルのシリンジに上清を移します。

サンプルループをロードするように設定します。シリンジからローディングポートに600〜700マイクロリットルのサンプルを注入することにより、500マイクロリットルのサンプルループをオーバーフィルします。次に、推奨流量と圧力で4ミリリットルのSECバッファーでサンプルを空にして、ループからカラムにサンプルを注入します。

バッファー容量の1.5倍が経過するまで同じ流速でカラムを運転し、カラム容量の0.25倍を通過した後、0.2ミリリットルの90フラクションの回収を開始します。マルチチャンネルピペットを使用して、90マイクロリットルのラボグレードの蒸留水をリザーバーから不透明な平底96ウェルプレートの各ウェルに移します。次に、10マイクロリットルのサンプルを96ウェルプレートから不透明な平底96ウェルプレートに移し、ウェルプレートをプレートリーダーに入れます。

蛍光標識されたGFPについては、シグナルを測定する前に、励起をできるだけ488ナノメートルに近づけ、507ナノメートルにできるだけ近い蛍光発光を検出します。プレートリーダーのEGFP検出のダイナミックレンジと増強緑色蛍光タンパク質の下限の調査では、プレートリーダーの検出下限が30ナノグラム、シグナル飽和前のウェルあたり最大500ナノグラムのEGFP標識タンパク質のダイナミックレンジがあることが示されました。溶出量をKavに変換し、対数分子量に対してプロットすることで、標準曲線の補間によってGタンパク質共役受容体の分子量を推定することができました。

最適な膜抽出条件は、スチレンマレイン酸コポリマーによる洗剤なしの抽出に対してDDMおよびラウリルマルトースネオペンチルグリコールをテストすることによって調査されました。蛍光サイズ排除クロマトグラフィープロファイルに対するリガンド添加の効果を、可溶化中にサンプルにスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を添加することによって調べました。S1Pの存在下で可溶化したサンプルは、凝集が減少した優れたトレースを示しました。

異なる条件下でのセロトニン受容体5HT2ARの長期安定性の調査は、スチレンマレイン酸脂質粒子中のタンパク質が、好ましくない温度でもより長く安定していることを示した。可溶化点からサンプルがSECカラムを通過するまでの時間はタイムクリティカルです。一時停止があってはならず、サンプルを冷たく保つ必要があります。

FSECに続いて、最良の構造、界面活性剤、またはバッファーの理解が得られます。これにより、タンパク質精製を最適化し、下流の生物物理学的および構造的特性評価をサポートします。