This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

LCMは、顕微鏡スライドおよびRNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質のその後の単離上の細胞又は組織切片からの組織の領域の離散的な集団の解剖のための強力な技術である。これらの技術の感度が向上し、必要な出発物質の量が減少するようなマイクロアレイ、次世代のRNA配列決定、DNAおよびプロテオミクスのエピジェネティックな分析などのハイスループット技術を用いた分析と組み合わせたLCMの使用がますます一般的になってきている8-12。 LCMで、より良い解剖学的分解能はサンプルに対して達成され、これらのサンプルの下流策から理解が大幅に強化される。 LCMの一つの注意点は、それが目的の細胞必ずしも必要ではないが、細胞の純粋な集団の濃縮サンプルを提供することである。精度の限界は、隣接する組織からのいくつかの汚染があることを意味する。しかし、この技術は、対象の細胞を濃縮し周囲の組織および細胞に関連する影響を最小限にし、関心対象の細胞に対する実験的な効果を最大化する。 間接免疫組織化学対ダイレクト LCMは、現在RNAが無傷に保ち、分離およびRNAの測定のために主に利用されているので、非常に重要な基準である。 RNAの完全性を維持することは、RNA（ 図10）を低下させる可能性が直接組織を染色する必要性を除去し、組織の切開を案内するための間接的な免疫組織化学の使用の背後にある主な根拠である。実験的な問題は、しかしながら、そのようなドーパミンニューロンなどの細胞の特定の集団の単離を必要とする場合、直接蛍光免疫組織化学が必要とされる。迅速な免疫組織化学標識プロトコールを使用して、処置中にRNAの分解を最小限に抑えることができる。短いインキュベーション時間は、一次及び二次抗高濃度の使用によるものであるボディ、10-20約2時間のインキュベーションとの従来の免疫組織化学のために必要なものより倍高い濃度。しかしながら、より長いインキュベーション時間が必要な場合は、ブラウン·スミスは、RNA分解を阻害し、長いインキュベーション時間（20時間まで）13との良好な品質のRNAを得るために、高塩緩衝液を使用した。組織およびLCMシステムへのアクセスを得るための標識との間に必要なかなりの時間がある場合は、この方法を使用することもできる。 PEN膜、シランプレップとコーティングされていないガラススライド-スライドの選択 LCMのためにコーティングされていないスライドガラスの使用は、14の報 ​​告されている。このコーティングは十分に組織の損失なしに、免疫組織化学のためのスライドに組織を添付し、それでもスライドからLCMキャップに対する組織の着脱を可能にするので私たちの研究室では、シランプレップスライドは、最適な選択であることが判明している。コー​​ティングされていないガラススライドを持っている免疫組織化学手順をいくつかの組織の損失を示した。間接的な免疫組織化学を使用する場合、しかし、組織保持はそれほど問題となる。シランプレップスライドのオフ適切な脱水、捕獲細胞や組織の問題ではなかった。この論文に記載さニューロンまたは脳領域を単離するための様々なアプローチの各々は、長所と短所がある。個々のドーパミンニューロンの単離のために、シラン準備スライドの使用は、より良い光学系の利点を有し、PEN膜スライドよりも安価である。欠点は、不十分な脱水がある場合、時々捕獲細胞が困難であるということである（下記参照）、いくつかの組織は、スライド上に残してもよい。 PEN膜スライドの利点は、IRレーザー、UVレーザーの組み合わせを使用すると、ドーパミンニューロンが収集されることを保証することである。それは、スライドガラスよりも脱水にあまり依存しないようにPEN膜から細胞が回収されない場合、発生することはほとんどないスライドします。アン<html>追加の利点は、UVレーザは、より密接にIRレーザーをガラススライドから離れニューロンを捕捉するための円と比較して、関心のあるニューロンの形状を近似するために使用することができることである。組織領域の単離のために、PEN膜スライドははるかに優れていると追加コストを正当化する。膜上で切り出した全ての組織の完全な除去は、このアプローチの結果は、単独のIRレーザーを使用して、組織の大きな領域を捕捉し、より厚い組織切片を採取することができるよりもはるかに高速である。唯一のIRレーザーを使用して、LCMキャップ膜全体を完全組織領域にわたって溶融することを必要とする。さらに、組織の不完全なコレクションは、典型的であり、通常、複数の試行が必要です。このPEN膜スライドから組織を単離するよりも時間がかかりますが利用可能な組織をガラススライド上に既にあるか、UVレーザが利用できない場合、組織の大部分は（ 図8J）を収集することができるように、これは実行可能な選択肢である。 ove_content &quot;&gt; 重要なステップ 100％エタノールのインキュベーションは、最も重要な工程の一つである。シランプレップスライドから細胞を収集するために、組織の完全な脱水が必要である。そのため、100％エタノールのインキュベーションに主に関連している削除されていないすべての水は、スライドから細胞をピックアップする能力に影響を与えます。この問題に対処するために、しばしば脱水に影響を与えることができる前の洗浄段階からの空気または転送からの水の吸収として、100％のエタノール溶液を変更する。また、モレキュラーシーブは、任意の水の汚染を吸収するために使用される。 LCMシステムは、理想的には、低湿度条件を維持するための除湿機の小さな部屋に配置する必要があります。 グッドクライオスタットのセクションでは、適切なLCMのために重要である。切片は最小化された組織における襞に平らにしておく必要があります。 LCMキャップとの間の距離を増加させ、tと接触するのを防止する組織にひだ彼は組織。その後、十分に組織上に膜キャップを溶融することが困難になる。スライドガラスは、典型的には、セクションの厚さは6と12ミクロンの間である必要がある。厚い部分は、PEN膜、スライドを撮像することができる。 LCMは、顕微鏡スライドからの組織および細胞の非常に正確な解剖をする技術的能力を提供しています。これは劇的に組織片の肉眼解剖と比較して、さらなる分析の分解能を増加させる。 LCMは、時間と労力を要することができ、が、他のハイスループット技術と組み合わせると、離散細胞または解剖学的領域が使用される場合、非常に生物学的プロセスの理解を高めることができ、広範囲の訓練又は専門知識を必要としない。

<html>すべての組織は、細胞のヘテロ接合個体群で構成されています。これはグリア細胞（オリゴデンドロサイト、ミクログリアとアストロサイト）の様々なタイプに囲まれ、様々な形態学的および/または神経化学的に異なる神経細胞からなる、脳組織のために特に関連する。さらに、このような皮質または脳幹の核の領域のような脳内の別個の領域は、特定の機能を有する。したがって、分析技術と組み合わせた場合、細胞の特定の集団または微小解剖学的に別個の領域を分離する能力（ すなわち 、Q-PCR、マイクロアレイ、RNA配列決定、およびプロテオミクス）は、著しく多様な生物学的プロセスの理解を高めることができる。 LCMは、RNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質などの様々な分子のさらなる分析のために、はるかに均一な供給源を提供する顕微鏡スライド上の組織から非常に離散的な解剖学的領域または特定の細胞を分離する能力を提供する技術である。 トン&quot;&gt; LCMが最初に導入されて以来、いくつかの異なるアプローチが組織1-3から細胞を顕微解剖するために使用されている。最古のアプローチは、赤外線（IR）レーザー及び熱可塑性フィルムと非を使用して、スライド上の組織の直接結合が含まれ接触方法チューブに細胞または組織とコレクションを切り離すためにレーザーを切断紫外線（UV）を用い、その後、LCMが正常組織および細胞型の様々な使用および下流の分析のための種々の分子の単離と互換性があることが示されているRNA、マイクロRNA、DNA、酵素活性1,4-7を含むタンパク質を含む。ここで、LCM切削UVレーザーを使用してLCMシステムおよび細胞または組織の周りに切断し、それを取り付けるためのキャプチャIRレーザーを用いて実証されているLCMキャップは、それぞれ、このLCMシステムは、プラスチックフィルムに細胞を付着し、tからそれを除去する目的の細胞または組織の上にキャップにプラスチックフィルムを溶融するIR捕捉レーザーの両方を使用してキャップを除去しながら、彼は組織（ 図1）。さらに、IRレーザーと組み合わせて、UVレーザーカットアウトするその後IRレーザー（ 図2）を使用してLCMキャップに組織を取り付けることによって単離した膜を有するスライド上に載せた組織から目的の組織または細胞を利用可能である。これらの技術の概要は、 図1および図2に見られる。 この手法にはいくつかのバリエーションを直接蛍光免疫組織化学および特異的タンパク質の発現に基づいて組織の領域を単離するために使用される間接的な免疫組織化学誘導技術を使用して特定の細胞を単離するためのいずれかに記載されている。具体的には、黒質および腹側被蓋領域および新鮮凍結脳組織からのRNAのその後の単離物の単離からドーパミン神経細胞の単離を示す。 RNAは、測定された分子の最も不安定であるため、目（DNAまたはタンパク質と比較して）RNAの完全性を維持するのに役立つ、EPSは含まれており、データが得られたRNAの量と質に表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:159px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Numer&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Veritas Laser Capture Microdissection System</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:121px;">Newer model is now sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure HS LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">PEN Membrane slides</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>s4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Silane prep-slides</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">95% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">100% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Rnase Free Triton</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MX1583D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Anti-Tyrosine hydroxyase antibody</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>Ab152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Stratagene MX 3005P</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>401513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Nanodrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Quant-iT RiboGreen</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、顕微鏡スライド上の個々の細胞又は組織切片の組織の正確な解剖学的領域の濃縮集団を単離するために使用される。免疫組織化学と組み合わせた場合、LCMは、特定のタンパク質マーカーに基づく個々の細胞型を単離することができる。ここで、LCM技法は、直接、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学で及びLCMのために使用されるものに隣接する部分に間接的なチロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学を使用して、腹側被蓋領域の領域を含むドーパミンニューロンの単離のために標識されたドーパミンニューロンの特定の集団を収集するために記載されている。赤外線（IR）レーザーをキャプチャの両方に使用される個々のニューロン、ならびにガラススライドオフおよび分析のためのLCMキャップ上に腹側被蓋領域を解剖する。 100％エタノール及びキシレンと組織の完全な脱水が重要である。 IR捕捉レーザー、紫外線（UV）cuttiの組み合わせngのレーザはPEN膜、スライドを使用した場合、個々のドーパミンニューロン又は腹側被蓋領域を分離するために使用される。 PEN膜、スライドは、より速い組織の大部分を収集して細胞を捕捉し、収集する際に優れた一貫性を提供するように、スライドガラス上で重要な利点を有するスライドからの組織の完全な除去で脱水し、結果にあまり依存している。ガラススライドからの組織の大部分の除去が可能であるが、それはかなり時間がかかり、しばしば背後にあるいくつかの残存組織を残す。ここに示したデータは、十分な量および質のRNAを定量PCR測定のためのこれらの手順を使用して得ることができることを示している。 RNAとDNAがマイクロRNAのLCM、分離および測定を採取した組織や細胞からの最も一般的に単離された分子であるが、DNA中のタンパク質およびエピジェネティックな変化はまた、強化された解剖学的および細胞の解決方法を利用することができますLCMを使用して得られた。

図6及び図7における顕微鏡写真は、個々のドーパミンニューロンの単離のための能力を実証する。一貫してLCMに製造することができる最小のスポットサイズは​​、セルを分離するためにキャップ現在の解剖学的分解能は、約5〜10μmである。特定の細胞型の単離のための唯一の制限は、細胞を可視化する能力である。 LCMは、個々のドーパミンニューロンを単離することができるが、隣接する非標識細胞の部品の汚染が最も起こりやすい。そのため、最終サンプルはドーパミンニューロンの濃縮コレクションではなく、ドーパミンニューロンの純粋な集団である。この技術は、腹側被蓋領域の分離を示すような脳内の離散的な核または領域のような組織の小さな領域を分離することが可能である。以前の刊行物は、脳組織におけるこの使用を実証しているだけでなく、正常組織5,11からの病理組織を単離する。 <pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt; LCMを用いて単離された細胞および組織の最も一般的な使用は、RNA分析であるため、提示手順はRNAの完全性を維持するために最適化した。 LCM以下のままであったRNAの品質を決定するために、RNAは、いずれかのアセトン中で急速チロシン水酸化酵素、蛍光免疫組織化学手順又は固定後、LCMの後、スライド上の組織から、シリカベースのスピンカラムを用いて単離した。 RNAの品質を測定し、市販の全脳RNAからのRNAの値（ 図9）と比較した。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、アセトン固定（RIN 2.6）、続いて免疫組織化学の後に低い整合性LCMのために使用される組織からのRNAサンプル（RIN利用できない）に減少したの相対的減少によってわかるように（RIN 8.2） S18のピークに比べrRNAのS28ピークの高さ。しかし、RNAは、18Sおよび28Sバンドを維持し、遺伝子発現をQ-PCRを用いて測定することができる。 <p class= &quot;jove_contentは&quot;&gt; LCMを介して取得したニューロン、ドーパミンニューロン（50、100および200ドーパミンニューロン）から得られたRNAの量を測定するために、シランプレップスライドから腹側被蓋領域から単離した。 RNAは、シリカベースのスピンカラムを用いて単離し、RNAの量を測定した。作成した標準曲線に基づいて、17.3の合計、24.8頁および50.9 pgの/μlの50,100および200ドーパミンニューロン、それぞれ（ 図10A）から単離した。 Q-PCR、逆転写されたドーパミンニューロンからの全脳RNAおよびRNAの濃度の範囲、以前5に記載のようにQ-PCRを用いて測定したβアクチン遺伝子をRNA量を測定した。これらの測定に基づいて、3.55、6.82および20.58頁/μlの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロン、それぞれ（ 図10B）から算出した。 ドーパミンニューロンの単離は全体Vの分離と比較する方法を実証するために、entral LCMと被蓋野、ドーパミンニューロン特異的遺伝子（Nurr1は、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン輸送体）は、サンプルのこれらの二つの異なる種類のQ-PCRで測定し、βアクチンの発現（ 図11）と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、βアクチンのために相対的なドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示している。これは、個々のドーパミンニューロンの単離はドーパミンニューロン特異的遺伝子の発現を集中方法を示しています。腹側被蓋領域サンプルにおいて、ドーパミンニューロン特異的遺伝子は、βアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現していないにも収集することができる他の細胞（非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞）のようにして希釈する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strongの&gt;赤外線（IR）捕捉レーザーを用いて、図1のレーザーキャプチャー。小さなプラスチックLCMキャップは、ガラススライド（ステップ1）に取り付けられた組織の上に配置される底部上の膜を有している。目的の組織または細胞が特定されると、IR捕捉レーザは、下にある組織/細胞（ステップ2）の上に、膜中の小さなくぼみを溶融するLCMキャップを介して発射される。 LCMキャップが除去されると、組織は、顕微鏡スライドから除去され、LCMキャップに付着したままである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> 赤外線（IR）捕捉レーザー、紫外線（UV）レーザーカッティングを用いて、図2のレーザー·キャプチャは、組織の大きな領域を取得またはUVレーザを用いた細胞の回収を容易にするために、組織は、膜とスライド上に搭載されている外側のコーナー（PEN膜スライド）に沿ってスライドに接続。 LCMキャップをt上に配置される彼組織及びIR捕捉レーザーキャップ膜を溶融し、LCMキャップに組織を取り付けるために使用される（ステップ1および2）。 UVカットレーザーは、次に（ステップ3および4）スライド膜および組織を切断するために使用されるキャップが取り外されたとき、そのような組織がスライドから除去し、LCMキャップ（ステップ5）上に残っている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムのロードマップ。図は。このレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムは、一度に3スライドのスペースがあります。スライドを顕微鏡にロードされるとき、各スライドの低倍率ロードマップ画像が生成される。ロードマップの画像上の領域を選択すると、その領域へのライブ画像ウィンドウに移動します。デモンストレーションの目的で、マウスの脳は3スライド上に10μmのセクションに区分した。最初のスライドは、チロシンヒドロキシラーゼのために標識したimmunoreactiviクロマゲン（A）としてジアミノベンジジンを用いて、TY。切片を、シラン-プレップスライド（B）またはPEN膜スライド（C） ​​のいずれかに取り付けた。これらのスライドの両方が急速蛍光チロシ​​ン水酸化免疫組織化学を使用して標識した。 （C）中の矢印は、スライドガラスにPEN膜の付着を示す。この境界の外ませ組織はLCMで採取することはできません。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> 図4. IR捕捉レーザーを使用した。IR捕捉レーザLCMキャップに組織に付着し、組織の残りの部分から取り外しLCMキャップ膜を溶融するために用いられる。 IR捕捉レーザは、下にある組織とスライドガラスに接触するように十分にLCMキャップ膜を溶融するために十分な強度でなければならない。レーザーが、膜を融解するには不十分であったときに上記画像が実証スライドに（2スポットを左）。溶融した膜は、スライドガラスに接触すると、太い黒い輪郭（右スポット）を観察することができる。レーザの強度は、電源（3-100 mW）と、パルス（100-1,000,000秒）及びレーザーの＃ヒット数を変えることによって調整することができる。さらに、同じスポットにおけるIRレーザーの繰り返し発射はさらに、膜を溶かすことができる。 IRレーザーの目的は、いつでもLCMキャップを移動させるか、目的が変更されたときに調整される必要がある。スケールバー=100μmである。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> 図5. UVカットレーザーを使用した。UVカットレーザPEN膜および組織を切断するために使用される。 UVレーザは、組織を損傷する可能性があるので、膜および組織を切断するのに必要な最小強度を使用する前に決定する必要がある。上記の、異なるUVレーザー強度の3つのスポット（矢印）がで示されている<html> 10μmの切片、厚い部分のための中間点と高すぎるUVレーザ強度​​を示す適切な場所に十分な左スポットサイズ。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> IRレーザーを使用して、チロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図6.直接単離。ドーパミンニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（A）のための迅速な蛍光標識後に示されている。 IRレーザがこれらのニューロン（D）上のLCMキャップ膜を溶融発生したときに、キャップの除去は、スライド（B、E）から離れ、これらの細胞を取り出す。 LCMキャップ（C、F）に取り付けられ、これらのニューロンは、その後可視化することができる。スケールバー=250μmの。= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> IRお ​​よびUVレーザーを使用して、PEN膜スライドからチロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図7.直接単離。チロシンヒドロキシラーゼラベルニューロンは（A）の上に示されている。これらのニューロンはIRレーザーを使用してLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー（B）を用いたPEN膜のスライドから切断することができる。スケールバー=250μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> 図8.間接<html>チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性を用いて、腹側被蓋領域の単離。腹側被蓋領域におけるドーパミンニューロンの位置は、標準的な免疫組織化学的手法（A及びE）を使用してセクションで可視化した。この免疫組織化学標識部分は、染色されていない隣接部分（B及びF）で腹側被蓋領域を見つけるための鋳型として使用した。 UVレーザーを用いて、腹側被蓋領域は、IRレーザーでLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー（CおよびD）でスライドから切断し、HS LCMキャップ（D）に取り付けられて示された。唯一のIRレーザーを用いたシランプレップスライドから単離された腹側被蓋領域はまた、マクロキャップ（FK）に取り付けられて示されている。複数の試みは、この領域（GおよびJの比較）からの組織の大部分を収集するために必要であることに注意してください。スケールバー=500μmの。PLOAD / 52336 / 52336fig8large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> 図9 RNA品質代表的電気泳動図であり、市販全脳RNA（A）およびRNAアセトン固定およびLCM（B）の後の節から単離されたまたは迅速な蛍光チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学およびLCM（C）の関連したゲル画像。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、免疫組織化学のために処理セクションに減少したものの、電気泳動図は、rRNAのS18及びS28のピークの存在に基づいて、主に無傷のRNAを示す。全脳RNA濃度は、8.2のRINと6.487 PG /μlであった。アセトン固定組織RNA濃度は、2.6のRINと5.036 PG /μlであった。 RNAは、免疫組織化学の時間後に得られた<html>広告4.474 PG /μLとRINの濃度は使用できませんでした。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> 図10. RNA量は。LCMを用いて得られたニューロンにおけるRNAの量を決定するために、RNA濃度の標準曲線は、蛍光分光器およびQ-PCRを用いて製造した。蛍光分光測定（A）の場合は、大規模なグラフは、RNA量の高い範囲を示しており、小型のグラフは、10 PG /μlにダウンこのアッセイの感度を示している。 50、100及び200ドーパミンニューロンから得られたRNAの濃度は、それぞれ、17.3、24.8および50.9 pgの/μlであった。 RNA量（B）を測定するためにQ-PCRを用いて、RNAの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロンから得られた、それぞれ、3.55、6.82および20.58頁/μlであった。 ES / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; 個々のドーパミンニューロンの分離とドーパミンニューロン特異的な遺伝子の図11.集中。ドーパミンニューロンのサンプル中のドーパミンニューロン特異的な遺伝子（のNurr1、チロシンヒドロキシラーゼ、およびドーパミントランスポーター）及びβアクチンの間のC T（ΔCtの ）の違いLCMで単離し腹側被蓋領域に示されている全体の腹側被蓋領域の解剖における発現と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、他の細胞（非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞）としてβアクチンする相対ドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示すであろうβアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現しない腹側被蓋領域サンプルに収集することができる。

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Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K ビュー.  Mississippi State University College of Veterinary Medicine. 個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。 

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

神経科学

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.