我々は、使用されたマウスの脊髄の組織サンプルを提供するためのミネソタ大学の李研究室に感謝したいと思います。この作品は、MBにMBに、ランディシェーバーがん研究とコミュニティ基金MBにミネソタ卵巣癌アライアンス（MOCA）による国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定または原稿の準備で何の役割も持っていません。

1.溶解緩衝液の調製<ol><li> 2 Mのストック溶液を作るために、脱イオン（DI）水にスクロースを溶解します。 0.22μmのポリフッ化ビニリデン（PVDF）フィルタを駆動し、真空を用いて、スクロースの2M溶液をフィルタリングします。 </li><li>嫌気条件下で500 mMのストック溶液およびストアを作成するためにDI水にジチオスレイトール（DTT）を溶解します。 100mMのストック溶液を作製するためにDI水に塩化マグネシウム（MgCl 2を） を溶解します。 50mMのストック溶液を作製するためにアデノシン三リン酸（ATP）DI水中の二ナトリウム水和物を溶解します。 </li><li> DI水中のトリズマ塩酸塩を溶解し、水酸化ナトリウム（NaOH）を用いてpHを調整することにより、pH7.4のTris溶液を作ります。 </li><li> 250 mMの、1mMの、5 ​​mMとのMgCl 2濃度は、1mMとATP濃度及び50mMのトリス濃度のDTT濃度のスクロース濃度で溶解緩衝液を作製するためにDI水に原液の部分を組み合わせます。例えば、トリス、50の535.3μLを混ぜます溶解緩衝液の10ミリリットルを作るためにMgCl 2を0μlを、スクロースの1.25ミリリットル、DTT20μlの、ATPを200μlとDI水の7.4947ミリリットル。これは、約20の実験のために使用することができます。 </li></ol>実験2.細胞を培養します<ol><li> 50mlコニカルチューブにDMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）の30ミリリットルを小分けして、メディアを作成します。 </li><li>ぬるま湯を入れた小さなビーカーに液体窒素保存から冷凍M17またはヒーラ細胞を転送します。 </li><li> 50mlコニカルチューブに細胞を移します。まず、セ​​ルバイアルに、いくつかのメディアを追加。その後、解凍の5秒以内に再懸濁した細胞を移します。 </li><li>細胞ペレットを得るために、5分間、450×gで細胞懸濁液を遠心。 T75フラスコに培地20mlのを追加します。 </li><li>吸引を用いて細胞からメディアを取り出します。細胞ペレットを再懸濁に新鮮な培地の5ミリリットルを追加します。 </li><li> T75フラスコ中の培地20mlに5ミリリットルの細胞懸濁液を移し、37℃でインキュベートします。 CH3日ごとにメディアをANGE。 </li></ol> 3.細胞の回収<ol><li>細胞に触れないように注意しながら、吸引を介してメディアを取り出します。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで細胞を洗浄します。吸引を使用してPBSを削除します。 </li><li> T75フラスコにトリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を3mlを加え、3分間37℃でインキュベートします。 </li><li>フラスコに新鮮な培地の6ミリリットルを追加し、細胞を再懸濁。 </li><li> 5分間290×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にサスペンションを転送します。 </li><li>上清を除去し、5mlのPBSを追加します。静かにペレットを破壊するためにチューブの底をタップします。 5分間290×gで遠心分離します。 </li><li>繰り返し手順3.6三回。 </li><li> PBSを除去し、新鮮な1mlのPBSで細胞を懸濁します。エッペンドルフチュー​​ブ（1.5ミリリットル）に移します。 5分間290×gでスピン。 </li></ol> 4.細胞溶解<ol><li>ピペットANを用いてペレットのおおよその体積を測定大量にガラスビーズを秤量dは1：1：1の体積比。溶解緩衝液中のペレットの2倍容量を追加します。 注意：ガラスビーズを追加する前にバッファを追加します。 </li><li>を溶解低温室にボルテックスすることによって4℃で30分間攪拌最大でエッペンドルフチュー​​ブ中の細胞。 </li><li>ビーズを解決する30秒200×gで遠心分離する簡単。上清を収集します。 </li><li>上清を前のように、ガラスビーズの同じ量を加えます。 </li><li> 4℃で30分間、最大攪拌で再びボルテックス。 </li><li>ガラスビーズを解決する30秒200×gで遠心分離する簡単。上清を収集します。 </li><li>核、膜および破壊されていない細胞を除去するために5分間、5030×gで遠心分離します。細胞溶解物である上清を、収集します。 </li></ol> 5.組織の均質化<ol><li>溶解バッファーにマウス脊髄組織の9溶液：1の体積質量を行います。 注：このメソッドは、異なるさまざまなに適用可能ですENT組織サンプル。 </li><li>残っていないチャンクが存在しないことを確実にするために30秒間均質化にレベル2の設定を使用して組織を均質化します。 </li><li>核、膜および破壊されていない細胞を除去するために、3分間5030×gでスピンダウン。 </li><li>溶解液である上清を、収集します。 </li></ol> 6.サンプルの誘導体化<ol><li>ピアースBCAタンパク質アッセイキットプロトコルによって指定されるように、比色、96ウェルプレートリーダーを使用して組織溶解物のタンパク質濃度を決定するために、96ウェルプレート分析でビシンコニン酸（BCA）を実行します。 </li><li>脱イオン（DI）水を用いて50μlに合計20μgのタンパク質に対応するアリコートを持参してください。 </li><li>溶液に、HA-UB-ビニルスルホン（VS）の1.35μMの2μlを添加して、37℃で1時間インキュベートします。これは、最終反応混合物中のプローブの50 nmの溶解物20μgの結果。これは、機能のDUBのタグ付けを確実にするために、大モル過剰です。 </li><li>私95℃で5分間のレムリ試料緩衝液中でサンプルをncubate。 52μlの反応体積の使用2×試料緩衝液26μlを、4×試料緩衝液13μlあるいは6×サンプル緩衝液8.87μlのため。 </li><li>ゲルをロードする前に、氷上で冷却します。 </li></ol> 7.ウエスタンブロット<ol><li>調製した試料の40μlの12ウェル4〜20％トリス - グリシンゲルをロード</li><li>イオンフロントが底に到達するまで、95 Vでゲルを実行します。 </li><li>ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上のゲルの一晩の転送を行います。 </li><li>アミドブラック染色で膜をインキュベートし、各レーン中のタンパク質の量を示す画像を得ることがmembaneをスキャンします。 </li><li>膜を脱色し、ブロックする1時間PBS中の5％ミルクでインキュベートします。 </li><li> 1の濃度の一次抗HA抗体で膜をインキュベートする：PBS中の5％ミルク10,000のいずれかを4℃で一晩または室温で4時間。 </li><li> fは3回の洗浄を行いますまたは0.1％のTween-20洗剤でPBS中で5分間ずつ。 </li><li> 1の濃度でマウス西洋ワサビペルオキシダーゼで膜をインキュベートする：少なくとも2時間、PBS 10,000 5％ミルク。 </li><li> 0.1％のTween-20洗剤でPBS中で5分間ずつ3回の洗浄を行います。 </li><li> PBSで5分間1回洗浄を行います。 </li><li> 10分間の化学発光検出試薬で膜をインキュベートし、化学発光検出器を用いて検出します。検出器の自動露出設定を使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ユビキチン化は、基本的な細胞活動であるので、調節機構を理解することは、疾患や病態のプロセスを発掘するための鍵である可能性があります。 HAの使用は、UB-媒介タンパク質分解を研究するための簡単​​な、しかし非常に適用可能な方法を提供し、ここで報告したUb由来の活性部位特異的プローブをタグ付け。この方法は、個別のDUBのそれぞれの研究よりも速く、安価です。 <p class=...

ユビキチン - プロテアソームシステム（UPS）は、哺乳動物細胞内の主要な分解経路の一つとして機能します。プロテアソームで分解のためにバインドされた基板は、共有結合、ユビキチン（Ubが）1のポリマーとタグ付けされています。標的基質は、分解のためのプロテアソームに入る前に、ポリユビキチンタグを削除する必要があります。脱ユビキチン化酵素として知られる酵素のクラス（のDUB）はユビキチン分子2の除去とリサイクルを担当しています。これは、セル3内の作業約100のDUBがあることがヒトゲノムから予測されています。 UB-媒介細胞プロセスを制御するのDUBのような大規模な数と、これらの酵素を研究するだけで発現レベルに関する情報を提供するmRNA技術が活性およびウェスタンブロッティングの情報を与えないので、課題を提示します。 インフルエンザ赤血球凝集素（HA）の使用は、共有結合を可能にするMOD活性部位指向プローブをUB-由来、タグ付け機能のDUBのification、したがって、ウェスタンブロット4のこれらの酵素の活性の直接可視化を提供します。プローブは、活性部位のシステイン残基5ため自殺基質として作用するC末端のチオール反応性基を有します。これらのプローブによれば、細胞の病理学的および生理学的状態の両方で、多くのDUB活性の潜在的な発現を研究することが可能です。 DUB活性の変化は、パーキンソン病、アルツハイマー病、貧血および様々な癌6-10のような病理学的条件の範囲に関与しています。この技術は、疾患の研究のための強力なツールを提供します。本論文では、ガラスビーズを用いて溶解されているHeLa細胞およびM17細胞におけるこの技術の適用を示します。さらに、我々は、マウスの脊髄組織サンプルでこのメソッドを使用する方法の概要を示します。この技術から得られた情報を識別するための出発点として使用することができ治療標的ならびに異なる疾患状態の研究のためのモデルを確立します。この技術の真の有用性は、単一のアッセイで複数のDUBに関する情報を提供する能力にあります。

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (homogenizer)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-driven filters 0.22 &amp;micro;m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, acid washed &amp;le;106 &amp;micro;m (~140 U.S. sieve)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; w/ filter cup 250 ml 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli&#039;s SDS-Sample Buffer (4x, reducing)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

ユビキチン - プロテアソーム系は、最近、神経変性疾患および癌を含む種々の病態に関与しています。この観点から、このシステムの調節機構を研究するための技術は、上記疾患の細胞および分子プロセスを解明するために不可欠です。本稿で概​​説した赤血球凝集素由来のユビキチンプローブの使用は、このシステムの研究のための貴重なツールとして機能します。本稿では、酵素活性を脱ユビキチン化の直接的な可視化を与えるアッセイを実行することを可能にする方法を詳述します。脱ユビキチン化酵素は、プロテアソーム分解を制御し、ユーザーが1つのアッセイで複数の酵素の活性を調査することができ、それらの活性部位での機能的相同性を共有します。溶解物を、穏やかな機械的な細胞破壊を介して得られた活性部位指向プローブと共にインキュベートします。非アクティブな酵素が結合していないままで機能的酵素は、プローブでタグ付けされています。実行で寧このアッセイは、ユーザが迅速かつ簡単な方法で活動し、複数の脱ユビキチン化酵素の潜在的な発現の両方の情報を取得します。現在の方法は、ヒト細胞における予測百脱ユビキチン化酵素のための個々の抗体を使用するよりも大幅に効率的です。

培養M17およびHeLa細胞は、プロトコル（3細胞収穫）に詳述する方法を用いて回収し、マウスの脊髄組織が得られました。細胞ペレット/脊髄組織は、試薬調製の項に記載の溶解緩衝液を用いて管に入れました。細胞ペレットをホモジナイザー（ 図1B）を用いてホモジナイズしたガラスビーズ（ 図1A）およびマウス脊髄組織サンプルを用いて溶解しました。溶解または均...

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Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K ビュー.  University of Minnesota. 現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

生化学

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

<meta charset="utf8"></head><body>切断アッセイを使用した神経発達障害におけるDUBバリアントの評価

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

要約

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ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

タンパク質のユビキチン化の検出

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定