著者らは、代表的な結果に記載されているようにMG-132の治療を伴う細胞ペレットの作成に関するセリーヌ・ジャンティの支援と、プロトコルで使用される大腸菌ペレットの提供に対するエリーゼ・モマーツに感謝したいと考えている。

1. 重いペプチド標準の調製
<ol><li>購入した重いペプチドのサプライヤーと品質に応じて、重いペプチドを希釈する必要があります。このプロトコルは、表1で報告されたペプチド配列を使用し、リジン(13C615N2-リジン)またはアルギニン(13C615N4-アルギニン)に修飾したC末端アミノ酸を有する。<ol>
<li>重いペプチドを混合し、50%アセトニトリル(ACN)と混合して、10μMの各ペプチドとのペプチドミックスを作成する。</li>
		<li>ペプチドミックスのアリコートを作成し、-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプル準備
<ol><li>サンプルのリシス 注: ユビキチン鎖の安定性は、サンプル調製中に考慮する必要があります。生物学的サンプルとバッファーを 4 °C で冷やし、できるだけ迅速にユビキチン安定化バッファーにサンプルを追加します。<ol>
<li>水に1 M NH4HCO3( 炭酸アンモニウム)の溶液を調製し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。</li>
		<li>水に200 mM N-エチルマライムミド(NEM)の溶液を準備します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファーは、50 mM NH4HCO3/10 mM NEM で 8 M 尿素を使用して準備します。 注:8 M尿素の5 mL溶液は尿素と飽和溶液で水の膨張を与えられて水のかなり少ない5 mLを必要とします。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°C以上のバッファーを準備しないでください。</li>
		<li>0.5 μG/μLのタンパク質を目指すユビキチン安定化バッファーで調べる生物学的サンプルを再中断し、サンプルに適した方法で細胞をライゼします。SFX 150ブランソンソニフィエを有する3つの10sパルスからなる超音波処理方法は、各パルス間の氷上で10のブレークを有する70%の強度に設定され、このプロトコルの細胞株に使用された。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>上清を新鮮な低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移す。サンプルは必要に応じて、この時点で-20 °Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルとコントロールの準備
	<ol>
<li>サンプルが凍結している場合は、尿素を急速に溶解させるために解凍されている間に混合します(例えば、サーモミキサーで)。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>20 μgのサンプルを新しい低結合マイクロ遠心分離チューブに移し、ユビキチン安定化バッファーでボリュームを 50 μL に調整します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファー(50 μL)の正規化されたボリュームを使用して、負のコントロールを作成します。このサンプルでは、各ペプチドの光バージョンが存在してはならないため、スパイクイン重いペプチドから生じる光の汚染を観察することができます。この陰性制御は、セクション3.1で説明したPRMの保持時間スケジューリングにも使用された。</li>
		<li>また、ユビキチン安定化バッファーと、ユビキチン安定化バッファー (50 μL) の正規化されたボリュームに市販のチェーンタイプを追加して、正のコントロールを作成しました。一般的に、K63、K48、および M1 が利用可能です。代表結果ではK48、K63、M1の20ngを利用した。</li>
	</ol></li>
	<li>還元、アルキル化、消化
	<ol>
<li>50 mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)の溶液を水中に調製し、サンプルをpH = 8に1 M NaOHで調整します。</li>
		<li>LBスープで栽培された大腸菌の培養液を5分間遠心してペレットを形成し、その後5μg/μLのユビキチン安定化バッファーで再懸濁する前にPBSで2倍洗浄した。</li>
		<li>各サンプルとコントロールに大腸菌の1μgを加えます。このプロトコルは大腸菌(DH10B)を使用しますが、ユビキチンのない任意の複雑なライセートを使用することができます。ユビキチンは、すべての真核生物に共通であることに注意してください。 注:大腸菌の母質マトリックスを使用すると、プラスチック製品への非特異的接着によるペプチドの損失を減少させます。これは、タンパク質含有量が限られている陰性コントロールまたはサンプルにおいて特に顕著であり、K6312の観察に強い影響を与える。</li>
		<li>MSグレード水で500 mMトリス(2-カルボックスエチル)ホスフィン(TCEP)の溶液を準備します(DTTは代替として使用することができます)。</li>
		<li>TCEPを最終的な濃度50 mMに加えることによって、サンプルとコントロールを減らします。室温(RT)で30分間インキュベートする前に短時間渦を起こさせる。DTTを使用する場合、温度を50°Cに上昇させる必要があります。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>550 mM クロロアセトアミド (CAA) の溶液を NH4HCO3で準備します。暗闇の中で保管してください。</li>
		<li>CAAを最終濃度55mMに添加して、サンプルとコントロールをアルキル化します。暗闇の中でRTで20分間インキュベートする前に短時間渦を起た。 注:CAAは、−GG修飾(114.0429)13と間違えられるリジン残基に対する二重カルバミドメチル改変(114.0429)の可能性を減少させる還元剤としてヨードアセトアミドの代わりに使用される。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する比率 1:25 (w/w) でサンプルに Endopeptidase LysC を加えます。37°Cで3時間インキュベートする。</li>
		<li>サンプルとコントロールを200 μLの50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)で希釈します。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する1:25 w/w比でサンプルにトリプシンを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。</li>
		<li>各サンプルおよび対照サンプルに対して1:10比v/vでMSグレード水に10%のギ酸(FA)溶液を加えます。pH が <3) C18 クリーンアップの前であることを確認し、必要に応じてさらにギ酸を追加します。</li>
		<li>各サンプルおよび対照に、セクション1で作成された重いペプチド標準の0.5 μLを加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>ペプチドのクリーンアップ
	<ol>
<li>いくつかのメーカーは、C18 クリーンアップのヒントやプレートを提供しています。使用する製品に関するメーカーの指示に従い、真空遠心分離機で溶出したペプチドをMS分析の準備を整えます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MSによる分析
<ol><li>重いペプチド標準に関する初期PRM分析を予定外の方法で実行します。<ol>
<li>乾燥したサンプルをMS負荷バッファー2%ACN/0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで再懸濁します。</li>
		<li>ナノフロー用に設計された逆相C18 分析カラム(75 μm x 15 cm、2 μm 100 Å C18 ビーズ)をHPLCに装備し、MSグレード水を交換する線形勾配を0.1%FAに0.1%含むACNで交換します。分析カラムの寿命を保つ犠牲トラップカラム(75 μm x 2 cm、3 μm、100 Å C18 ビーズ)は、ここで使用しましたが、必須ではありません。</li>
		<li>分析カラムの出力を高解像度の質量分析計上のナノESIソースに結合します。</li>
		<li>質量分析計に適当な標的プロテオミクス法を利用する。たとえば、Q-Exactive と 2 つの実験方法では、完全 MS と PRM 実験の間でサイクルを行います。完全な MS 実験では、最大 IT として 1e6 と 240 ミリ秒の AGC 目標を持つ 120,000 の解像度が使用されました。PRM実験では、同じAGC目標と最大ITを使用し、解像度は60,000、分離ウィンドウは1.2 m/zでした。</li>
		<li>HPLCオートサンプラーを使用して、200 ngの陰性制御を分析カラムに注入します。分析カラムのサンプルに線形勾配を適用し、ACN濃度を〜45分の期間で2~25%上昇させます。 注:25%のACN濃度は、典型的なユビキチントポロジ特性ペプチドの親水性が低いため、プロテオミクスでは通常より低くなっています。他のペプチドが定量化される場合、より高いACN濃度が良好な標的分離を達成することが望まれる。</li>
		<li>セクション 4.2 で説明したように、スケジュール実行の結果を分析して、スケジュール済み対象リストを作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの分析<ol>
<li>セクション 4.2 で作成されたスケジュール済み包含リストを使用する場合とは別に、3.1 でのスケジュールの説明に従って残りのサンプルを実行します。 注: 前の実行からの繰り越しが後続のサンプルで検出されないように、正のコントロールの後にブランクを実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ソフトウェア分析
<ol><li>使用する MS に適した書式の一覧を作成します。このプロトコルは、オープンソースソフトウェアSkyline(バージョン19.1.0.193)(https://skyline.ms)を使用し、十分に文書化されたサポートとヘルプを提供しています。包含リストは、エクスポート隔離リスト機能を使用して、複数の質量分析計に対して作成できます。<ol>
<li>新しいスカイライン ドキュメントを開きます。</li>
		<li>重いトポロジ特性ペプチドに適した重い同位体修飾を選択します。[設定] で|[変更]タブの下にある[ペプチド設定]をクリックし、名前フィールドをクリックして、潜在的な変更を確認します。選択は、購入した重いペプチドの同位体状態に基づく。この例では、C末語で重リジン(13C615N2-リジン)または重アルギニン(13C615N4-アルギニン)のいずれかを担持した合成ペプチドが使用された。適切なラベルは、「ラベル:13C(6)15N(2)(C-用語K)」と「ラベル:13C(6)15N(4)(C項R)」となります。</li>
		<li>[設定]を選択します|遷移:[フィルタ] タブには、前駆体料金2、3、4 が含まれます。 </li>
		<li>[編集]を選択してペプチドを挿入します|挿入|ペプチド .</li>
		<li>トポロジ特性ペプチド配列とタンパク質名(例えば、「Chain–K63」)を含む関連フィールドを記入してください。</li>
		<li>ターゲットパネルに表示されている各ペプチドを展開します。不要な充電状態を削除します。好ましい電荷状態および衝突エネルギーは、使用される質量分析計に基づいて異なる場合があり、トポロジ特性ペプチドごとに表1に示されている。</li>
		<li>トポロジ特性ペプチドごとに(GGがシーケンスに含まれているM1を除く)、シーケンスを右クリックして [修正]を選択します。名前フィールドをクリックして <すべてを表示.> を選択する前に "GlyGly (K)"。</li>
		<li>分離リストファイルをエクスポート します|輸出|[隔離リスト]で、計測器の種類を選択し、メソッドの種類を [標準] に設定します。 [OK] を 選択すると、PRM メソッドの作成に使用できる *.csv ファイルを保存するプロンプトが開きます。</li>
	</ol></li>
	<li>オープンソースのSkylineソフトウェアを使用して、ここで説明する重いペプチドスケジューリングの実行に基づいて、スケジュールされた包含リストを作成します。<ol>
<li>セクション 4.1 で説明されているようにターゲット リストを作成します。</li>
		<li>[ファイル]を選択して、スケジューリング実行を 3.1 でインポート します|インポート|結果:</li>
		<li>ID を確認します。各ペプチドの重いシグナルは、重いペプチドのエントリごとに質量をクリックすることによって観察可能です。ピークの正しい認識は自動的に決定されることが多いが、ソフトウェアはクリックしてX軸下にドラッグしてピークを選択することによって手動キュレーションを必要とする場合がある。</li>
		<li>重いバリアントに対して選択された保持時間もライト バージョンに適用され、PRM のスケジュールが作成されます。スケジュール設定ウィンドウは、[設定]で変更できます|[予測] タブを使用して、タイム ウィンドウを変更してペプチド設定を行います。</li>
		<li>スケジュールされた対象リストを File を使用してエクスポートできるようになりました |輸出|分離 リストを選択し、適切な機器の種類と設定方法の種類を [スケジュール済み] にします。</li>
	</ol></li>
	<li>データを分析します。<ol>
<li>セクション 4.2 のスケジューリング実行分析と同じ方法でサンプルをインポートします。</li>
		<li>すべてのサンプルを完全にインポートした後、遷移のキュレーションを推奨します。これは、干渉や低い信号対雑音比を持つ遷移を除去するプロセスです。キュレーション前後のクロマトグラムの例を 図4に示します。</li>
		<li>データをエクスポートするには、関連するグラフを右クリックして[データを コピー ]を選択するか、[ファイル]を選択 します|輸出|結果:</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. 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著者らは競合する利益を宣言しない。

プロテオーム内のユビキチン状態の解析は、多種多様な生物学的問題に対して重要性を増している。サンプルのユビキチン化状態の記述は、ユビキチン化されるタンパク質のプロファイルだけでなく、ユビキチン化のトポロジーにも焦点を当てる必要があります。ここで説明するように、標的MSによるこのトポロジーの評価は、広範囲の生物学的調査において役割を有する。
<p class="jove_con...

タンパク質の機能と安定性の密接な調節は、生物学の表現法制御の主要な原動力であるため、最も重要です。タンパク質の機能は、その本質的なポリペプチド配列と翻訳後修飾(PTM)の2つの成分から構成されます。グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化1など、様々な化学PTMが同定されている。1975年、Goldsteinらの2 は小さなタンパク質を同定し、そのユビキタスな性質のためにユビキチンと名付けた。ユビキチンはタンパク質分解3において重要であることが判明した。しかし、それ以来、シグナル分子としてのユビキチンの機能は、タンパク質安定性の調節をはるかに超えて広がったことが確立されています。ユビキチンシグナル伝達は、タンパク質安定化、オートファジー、細胞周期制御、およびタンパク質の人身売買4のような他の生物学的機能の広い範囲に関与している。
他のPTMは一般的に、特定の部位に対してバイナリ(すなわち、タンパク質が改変または未修飾のまま)であるが、ユビキチンは単量体またはポリマー鎖の両方としてタンパク質を修飾することができ、その後ユビキチン自体はユビキチン化される。また、このポリユビキチン化鎖は、前のユビキチンのユビキチン化を伴ういくつかのトポロジーで開発することができ、8つのリンケージサイト5、6のいずれかに付着している。ユビキチンは、ユビキチンのC末端が7つのリジン残基(K06、K11、K27、K29、K33、K48、またはK63)または以前のユビキチンのN末端(M1または線形5と呼ばれる)にリンクされている多段階酵素プロセス(図1)によって伝達される。この連鎖トポロジーは、修飾下のタンパク質の運命の鍵です。例えば、K48またはK11連結鎖を用いた修飾はプロテアソームでの改変タンパク質の分解をもたらし、一方、NF-kBシグナル伝達の活性化には線形鎖が必要である。したがって、これらの連鎖トポロジの相対的分布は、多種多様な生物学的問題に関連する。
質量分析(MS)の使用は、ユビキチン鎖トポロジ解析には、抗体ベースまたは親和性に基づく相互作用7,8に依存しておらず、その多くは特異性が限られており、様々な鎖型を区別しないため、特に有益である。別の検出可能性は、遺伝子組み換えユビキチン変異体を使用しています。ここで、特定のリジンはアルギニンと交換され、ユビキチンによる修飾を支持することができない。基質タンパク質上のユビキチン鎖形成の欠如は、特定のトポロジ9の証拠として解釈される。
ユビキチン化タンパク質のMSベース同定は、ユビキチンのC末端に、MS分析のためのサンプルのタンパク質分解調製中にトリプシンによって認識される74位にアルギニン残基が含まれているという事実に基づいており、C末端のダブルグリシンを分離する。このGlyGly(-GG)は、基質タンパク質のリジン残基のε-アミノ基に結合したままである。ユビキチントポロジ解析では、ユビキチンの7つのリジン残基のうちの1つに修飾が起こります。これにより、GGによって修飾されたリジン残基を持つ7つの主要なペプチドのセットが作成され、各トポロジーに固有である(図2)。例えば、K06トポロジーでは、アミノ酸配列の位置6のリジンは、このリジンに114 Daの-GG修飾を加えてトリプシン消化から保護される。
MSによる特定の所定のペプチドの同定は、標的プロテオミクス、またはより具体的には、標的ペプチド獲得10と呼ばれる。使用されている質量分析計の性能に応じて、2つの方法が開発されています。これらは、反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および並列反応モニタリング(PRM)とも呼ばれる選択される。SRM では、前駆体 m/z と製品イオン m/z からなる遷移の選択が行われます。反対に、PRM は前駆体 m/z のみを必要とします。選択後、生成イオンの完全な調査スキャンが行われる。これは、測定11の前に、特定の質量分析計で定量するための適切な生成イオンの選択が不要であるという利点を有する。SRM と PRM の両方を、計測器に応じてスケジュールできます。スケジューリングとは、特定のイオンが分析に含まれる時間枠を割り当てる練習であり、ペプチドはクロマトグラフィーシステムから定義された保持時間で溶出します。特定の時点で尋問されるイオンの数を減らすことは、その時点で予定されているイオンの尋問の頻度を増加させ、したがって、データの精度を向上させます。
一般に、ユビキチントポロジーに対する標的プロテオミクスの適用は、他の標的プロテオミクス実験と同じである。しかし、2つの重要な違いが重要である:まず、ユビキチン鎖の安定性を考慮する必要があります。細胞のリシス時に鎖を急速に分解する複数の強力なデュービキチン化酵素(DUB)があります。ユビキチン特異的プロテアーゼは、チオエステラーゼとメタロプロテアーゼの2つのカテゴリーに分類されます。ユビキチン-ヒドロラーゼのほとんどはチオエステラーゼであり、活性中心にシステイン残基を運ぶ。このシステイン残基をアルキル化することにより、不活性化することができる。したがって、N-エチルマレイミド(NEM)のようなアルキル化剤を含むユビキチン安定化バッファーと高変性化学物質の使用、およびサンプルを冷やして保持することは、分析を成功させるために不可欠です。第2に、他の標的実験とは異なり、ペプチドの選択は固定される。典型的な標的実験では、タンパク質ペプチドを選んで、クロマトグラフィーとイオン化の性能を良好にします。K48のようないくつかのトポロジ特性ペプチドは、これらの特性は良好であるが、他の人にとっては、それらはあまり望ましくない。例えば、典型的な逆相セットアップにおけるK33クロマトグラフィーは、伸伸溶性プロファイルの形成により不良であり、かつK27ペプチドのイオン化特性が悪いため、MS12によってその視認性が低下する。
本プロトコルでは、PRMによる生体試料のユビキチントポロジアセスメントを行う方法について説明する。この手順のサンプルデータは、いくつかの異なる細胞タイプにおけるMG-132阻害剤処理を用いたプロテアソームの摂動を用いて提示される。

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Peptides</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Chain M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Branson sonifier</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters &amp;mu;Elution C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; plates</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

プロテオーム内のユビキチン鎖トポロジーのグローバルプロファイルの評価は、幅広い生物学的問題に答える上で興味深いものです。ここで概説するプロトコルは、鎖に組み込まれたユビキチンのトリプティック消化後に残されたジグリシン(-GG)修飾を利用する。これらのトポロジ特性ペプチドを定量化することにより、ユビキチン鎖トポロジーの相対的な存在量を求めることができる。これらのペプチドを並列反応モニタリング実験で定量するために必要なステップは、ユビキチン鎖の安定化を考慮して報告されている。重いコントロール、細胞の分解、および消化の準備は、適切な質量分析計のセットアップとデータ分析のワークフローと共に記述されています。ユビキチントポロジーにおける摂動を伴うデータセットの例は、プロトコルの最適化が結果に与える影響の例を伴って提示される。概説された手順に従うことによって、ユーザーは生物学的文脈の中でユビキチントポロジ景観のグローバル評価を行うことができる。

PRMによるユビキチン鎖分析の使用を実証するために、マウスメラノーマ細胞株B16と2つの一般的なヒト細胞株A549(腺癌性肺胞基底細胞)およびHeLa(子宮頸癌細胞)の3つの細胞株が選択された。これらの培養物は、収穫前に4時間0、10、または100 mM MG-132で処理される前に、適切な培地で中電関数的な相に成長した。MG-132は、プロテアソーム14によるユビキチン共役タンパク質の分解?...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K ビュー.  Luxembourg Institute of Health. この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。

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Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

生化学

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

<meta charset="utf8"></head><body>切断アッセイを使用した神経発達障害におけるDUBバリアントの評価

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases in ubiquitin-proteasome activity are critical for synaptic plasticity and memory formation and aberrant changes in this system are associated with a variety of neurological, neurodegenerative and psychiatric disorders. One of the issues in studying ubiquitin-proteasome functioning in the brain is that it is present in all cellular compartments, in which the protein targets, functional role and mechanisms of regulation can vary widely. As a result, the ability to directly compare brain ubiquitin protein targeting and proteasome catalytic activity in different subcellular compartments within the same animal is critical for fully understanding how the UPS contributes to synaptic plasticity, memory and disease. The method described here allows collection of nuclear, cytoplasmic and crude synaptic fractions from the same rodent (rat) brain, followed by simultaneous quantification of proteasome catalytic activity (indirectly, providing activity of the proteasome core only) and linkage-specific ubiquitin protein tagging. Thus, the method can be used to directly compare subcellular changes in ubiquitin-proteasome activity in different brain regions in the same animal during synaptic plasticity, memory formation and different disease states. This method can also be used to assess the subcellular distribution and function of other proteins within the same animal.

This protocol is designed to efficiently quantify ubiquitin-proteasome system (UPS) activity in different cellular compartments of the rodent brain. Users are able to examine UPS functioning in nuclear, cytoplasmic and synaptic fractions in the same animal, reducing the amount of time and number of animals needed to perform these complex analyses.

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

神経科学

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

要約

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標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

タンパク質のユビキチン化の検出

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法