著者らは、代表的な結果に記載されているようにMG-132の治療を伴う細胞ペレットの作成に関するセリーヌ・ジャンティの支援と、プロトコルで使用される大腸菌ペレットの提供に対するエリーゼ・モマーツに感謝したいと考えている。

1. 重いペプチド標準の調製
<ol><li>購入した重いペプチドのサプライヤーと品質に応じて、重いペプチドを希釈する必要があります。このプロトコルは、表1で報告されたペプチド配列を使用し、リジン(13C615N2-リジン)またはアルギニン(13C615N4-アルギニン)に修飾したC末端アミノ酸を有する。<ol>
<li>重いペプチドを混合し、50%アセトニトリル(ACN)と混合して、10μMの各ペプチドとのペプチドミックスを作成する。</li>
		<li>ペプチドミックスのアリコートを作成し、-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプル準備
<ol><li>サンプルのリシス 注: ユビキチン鎖の安定性は、サンプル調製中に考慮する必要があります。生物学的サンプルとバッファーを 4 °C で冷やし、できるだけ迅速にユビキチン安定化バッファーにサンプルを追加します。<ol>
<li>水に1 M NH4HCO3( 炭酸アンモニウム)の溶液を調製し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。</li>
		<li>水に200 mM N-エチルマライムミド(NEM)の溶液を準備します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファーは、50 mM NH4HCO3/10 mM NEM で 8 M 尿素を使用して準備します。 注:8 M尿素の5 mL溶液は尿素と飽和溶液で水の膨張を与えられて水のかなり少ない5 mLを必要とします。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°C以上のバッファーを準備しないでください。</li>
		<li>0.5 μG/μLのタンパク質を目指すユビキチン安定化バッファーで調べる生物学的サンプルを再中断し、サンプルに適した方法で細胞をライゼします。SFX 150ブランソンソニフィエを有する3つの10sパルスからなる超音波処理方法は、各パルス間の氷上で10のブレークを有する70%の強度に設定され、このプロトコルの細胞株に使用された。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>上清を新鮮な低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移す。サンプルは必要に応じて、この時点で-20 °Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルとコントロールの準備
	<ol>
<li>サンプルが凍結している場合は、尿素を急速に溶解させるために解凍されている間に混合します(例えば、サーモミキサーで)。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>20 μgのサンプルを新しい低結合マイクロ遠心分離チューブに移し、ユビキチン安定化バッファーでボリュームを 50 μL に調整します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファー(50 μL)の正規化されたボリュームを使用して、負のコントロールを作成します。このサンプルでは、各ペプチドの光バージョンが存在してはならないため、スパイクイン重いペプチドから生じる光の汚染を観察することができます。この陰性制御は、セクション3.1で説明したPRMの保持時間スケジューリングにも使用された。</li>
		<li>また、ユビキチン安定化バッファーと、ユビキチン安定化バッファー (50 μL) の正規化されたボリュームに市販のチェーンタイプを追加して、正のコントロールを作成しました。一般的に、K63、K48、および M1 が利用可能です。代表結果ではK48、K63、M1の20ngを利用した。</li>
	</ol></li>
	<li>還元、アルキル化、消化
	<ol>
<li>50 mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)の溶液を水中に調製し、サンプルをpH = 8に1 M NaOHで調整します。</li>
		<li>LBスープで栽培された大腸菌の培養液を5分間遠心してペレットを形成し、その後5μg/μLのユビキチン安定化バッファーで再懸濁する前にPBSで2倍洗浄した。</li>
		<li>各サンプルとコントロールに大腸菌の1μgを加えます。このプロトコルは大腸菌(DH10B)を使用しますが、ユビキチンのない任意の複雑なライセートを使用することができます。ユビキチンは、すべての真核生物に共通であることに注意してください。 注:大腸菌の母質マトリックスを使用すると、プラスチック製品への非特異的接着によるペプチドの損失を減少させます。これは、タンパク質含有量が限られている陰性コントロールまたはサンプルにおいて特に顕著であり、K6312の観察に強い影響を与える。</li>
		<li>MSグレード水で500 mMトリス(2-カルボックスエチル)ホスフィン(TCEP)の溶液を準備します(DTTは代替として使用することができます)。</li>
		<li>TCEPを最終的な濃度50 mMに加えることによって、サンプルとコントロールを減らします。室温(RT)で30分間インキュベートする前に短時間渦を起こさせる。DTTを使用する場合、温度を50°Cに上昇させる必要があります。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>550 mM クロロアセトアミド (CAA) の溶液を NH4HCO3で準備します。暗闇の中で保管してください。</li>
		<li>CAAを最終濃度55mMに添加して、サンプルとコントロールをアルキル化します。暗闇の中でRTで20分間インキュベートする前に短時間渦を起た。 注:CAAは、−GG修飾(114.0429)13と間違えられるリジン残基に対する二重カルバミドメチル改変(114.0429)の可能性を減少させる還元剤としてヨードアセトアミドの代わりに使用される。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する比率 1:25 (w/w) でサンプルに Endopeptidase LysC を加えます。37°Cで3時間インキュベートする。</li>
		<li>サンプルとコントロールを200 μLの50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)で希釈します。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する1:25 w/w比でサンプルにトリプシンを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。</li>
		<li>各サンプルおよび対照サンプルに対して1:10比v/vでMSグレード水に10%のギ酸(FA)溶液を加えます。pH が <3) C18 クリーンアップの前であることを確認し、必要に応じてさらにギ酸を追加します。</li>
		<li>各サンプルおよび対照に、セクション1で作成された重いペプチド標準の0.5 μLを加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>ペプチドのクリーンアップ
	<ol>
<li>いくつかのメーカーは、C18 クリーンアップのヒントやプレートを提供しています。使用する製品に関するメーカーの指示に従い、真空遠心分離機で溶出したペプチドをMS分析の準備を整えます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MSによる分析
<ol><li>重いペプチド標準に関する初期PRM分析を予定外の方法で実行します。<ol>
<li>乾燥したサンプルをMS負荷バッファー2%ACN/0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで再懸濁します。</li>
		<li>ナノフロー用に設計された逆相C18 分析カラム(75 μm x 15 cm、2 μm 100 Å C18 ビーズ)をHPLCに装備し、MSグレード水を交換する線形勾配を0.1%FAに0.1%含むACNで交換します。分析カラムの寿命を保つ犠牲トラップカラム(75 μm x 2 cm、3 μm、100 Å C18 ビーズ)は、ここで使用しましたが、必須ではありません。</li>
		<li>分析カラムの出力を高解像度の質量分析計上のナノESIソースに結合します。</li>
		<li>質量分析計に適当な標的プロテオミクス法を利用する。たとえば、Q-Exactive と 2 つの実験方法では、完全 MS と PRM 実験の間でサイクルを行います。完全な MS 実験では、最大 IT として 1e6 と 240 ミリ秒の AGC 目標を持つ 120,000 の解像度が使用されました。PRM実験では、同じAGC目標と最大ITを使用し、解像度は60,000、分離ウィンドウは1.2 m/zでした。</li>
		<li>HPLCオートサンプラーを使用して、200 ngの陰性制御を分析カラムに注入します。分析カラムのサンプルに線形勾配を適用し、ACN濃度を〜45分の期間で2~25%上昇させます。 注:25%のACN濃度は、典型的なユビキチントポロジ特性ペプチドの親水性が低いため、プロテオミクスでは通常より低くなっています。他のペプチドが定量化される場合、より高いACN濃度が良好な標的分離を達成することが望まれる。</li>
		<li>セクション 4.2 で説明したように、スケジュール実行の結果を分析して、スケジュール済み対象リストを作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの分析<ol>
<li>セクション 4.2 で作成されたスケジュール済み包含リストを使用する場合とは別に、3.1 でのスケジュールの説明に従って残りのサンプルを実行します。 注: 前の実行からの繰り越しが後続のサンプルで検出されないように、正のコントロールの後にブランクを実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ソフトウェア分析
<ol><li>使用する MS に適した書式の一覧を作成します。このプロトコルは、オープンソースソフトウェアSkyline(バージョン19.1.0.193)(https://skyline.ms)を使用し、十分に文書化されたサポートとヘルプを提供しています。包含リストは、エクスポート隔離リスト機能を使用して、複数の質量分析計に対して作成できます。<ol>
<li>新しいスカイライン ドキュメントを開きます。</li>
		<li>重いトポロジ特性ペプチドに適した重い同位体修飾を選択します。[設定] で|[変更]タブの下にある[ペプチド設定]をクリックし、名前フィールドをクリックして、潜在的な変更を確認します。選択は、購入した重いペプチドの同位体状態に基づく。この例では、C末語で重リジン(13C615N2-リジン)または重アルギニン(13C615N4-アルギニン)のいずれかを担持した合成ペプチドが使用された。適切なラベルは、「ラベル:13C(6)15N(2)(C-用語K)」と「ラベル:13C(6)15N(4)(C項R)」となります。</li>
		<li>[設定]を選択します|遷移:[フィルタ] タブには、前駆体料金2、3、4 が含まれます。 </li>
		<li>[編集]を選択してペプチドを挿入します|挿入|ペプチド .</li>
		<li>トポロジ特性ペプチド配列とタンパク質名(例えば、「Chain–K63」)を含む関連フィールドを記入してください。</li>
		<li>ターゲットパネルに表示されている各ペプチドを展開します。不要な充電状態を削除します。好ましい電荷状態および衝突エネルギーは、使用される質量分析計に基づいて異なる場合があり、トポロジ特性ペプチドごとに表1に示されている。</li>
		<li>トポロジ特性ペプチドごとに(GGがシーケンスに含まれているM1を除く)、シーケンスを右クリックして [修正]を選択します。名前フィールドをクリックして <すべてを表示.> を選択する前に "GlyGly (K)"。</li>
		<li>分離リストファイルをエクスポート します|輸出|[隔離リスト]で、計測器の種類を選択し、メソッドの種類を [標準] に設定します。 [OK] を 選択すると、PRM メソッドの作成に使用できる *.csv ファイルを保存するプロンプトが開きます。</li>
	</ol></li>
	<li>オープンソースのSkylineソフトウェアを使用して、ここで説明する重いペプチドスケジューリングの実行に基づいて、スケジュールされた包含リストを作成します。<ol>
<li>セクション 4.1 で説明されているようにターゲット リストを作成します。</li>
		<li>[ファイル]を選択して、スケジューリング実行を 3.1 でインポート します|インポート|結果:</li>
		<li>ID を確認します。各ペプチドの重いシグナルは、重いペプチドのエントリごとに質量をクリックすることによって観察可能です。ピークの正しい認識は自動的に決定されることが多いが、ソフトウェアはクリックしてX軸下にドラッグしてピークを選択することによって手動キュレーションを必要とする場合がある。</li>
		<li>重いバリアントに対して選択された保持時間もライト バージョンに適用され、PRM のスケジュールが作成されます。スケジュール設定ウィンドウは、[設定]で変更できます|[予測] タブを使用して、タイム ウィンドウを変更してペプチド設定を行います。</li>
		<li>スケジュールされた対象リストを File を使用してエクスポートできるようになりました |輸出|分離 リストを選択し、適切な機器の種類と設定方法の種類を [スケジュール済み] にします。</li>
	</ol></li>
	<li>データを分析します。<ol>
<li>セクション 4.2 のスケジューリング実行分析と同じ方法でサンプルをインポートします。</li>
		<li>すべてのサンプルを完全にインポートした後、遷移のキュレーションを推奨します。これは、干渉や低い信号対雑音比を持つ遷移を除去するプロセスです。キュレーション前後のクロマトグラムの例を 図4に示します。</li>
		<li>データをエクスポートするには、関連するグラフを右クリックして[データを コピー ]を選択するか、[ファイル]を選択 します|輸出|結果:</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

プロテオーム内のユビキチン状態の解析は、多種多様な生物学的問題に対して重要性を増している。サンプルのユビキチン化状態の記述は、ユビキチン化されるタンパク質のプロファイルだけでなく、ユビキチン化のトポロジーにも焦点を当てる必要があります。ここで説明するように、標的MSによるこのトポロジーの評価は、広範囲の生物学的調査において役割を有する。
<p class="jove_con...

タンパク質の機能と安定性の密接な調節は、生物学の表現法制御の主要な原動力であるため、最も重要です。タンパク質の機能は、その本質的なポリペプチド配列と翻訳後修飾(PTM)の2つの成分から構成されます。グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化1など、様々な化学PTMが同定されている。1975年、Goldsteinらの2 は小さなタンパク質を同定し、そのユビキタスな性質のためにユビキチンと名付けた。ユビキチンはタンパク質分解3において重要であることが判明した。しかし、それ以来、シグナル分子としてのユビキチンの機能は、タンパク質安定性の調節をはるかに超えて広がったことが確立されています。ユビキチンシグナル伝達は、タンパク質安定化、オートファジー、細胞周期制御、およびタンパク質の人身売買4のような他の生物学的機能の広い範囲に関与している。
他のPTMは一般的に、特定の部位に対してバイナリ(すなわち、タンパク質が改変または未修飾のまま)であるが、ユビキチンは単量体またはポリマー鎖の両方としてタンパク質を修飾することができ、その後ユビキチン自体はユビキチン化される。また、このポリユビキチン化鎖は、前のユビキチンのユビキチン化を伴ういくつかのトポロジーで開発することができ、8つのリンケージサイト5、6のいずれかに付着している。ユビキチンは、ユビキチンのC末端が7つのリジン残基(K06、K11、K27、K29、K33、K48、またはK63)または以前のユビキチンのN末端(M1または線形5と呼ばれる)にリンクされている多段階酵素プロセス(図1)によって伝達される。この連鎖トポロジーは、修飾下のタンパク質の運命の鍵です。例えば、K48またはK11連結鎖を用いた修飾はプロテアソームでの改変タンパク質の分解をもたらし、一方、NF-kBシグナル伝達の活性化には線形鎖が必要である。したがって、これらの連鎖トポロジの相対的分布は、多種多様な生物学的問題に関連する。
質量分析(MS)の使用は、ユビキチン鎖トポロジ解析には、抗体ベースまたは親和性に基づく相互作用7,8に依存しておらず、その多くは特異性が限られており、様々な鎖型を区別しないため、特に有益である。別の検出可能性は、遺伝子組み換えユビキチン変異体を使用しています。ここで、特定のリジンはアルギニンと交換され、ユビキチンによる修飾を支持することができない。基質タンパク質上のユビキチン鎖形成の欠如は、特定のトポロジ9の証拠として解釈される。
ユビキチン化タンパク質のMSベース同定は、ユビキチンのC末端に、MS分析のためのサンプルのタンパク質分解調製中にトリプシンによって認識される74位にアルギニン残基が含まれているという事実に基づいており、C末端のダブルグリシンを分離する。このGlyGly(-GG)は、基質タンパク質のリジン残基のε-アミノ基に結合したままである。ユビキチントポロジ解析では、ユビキチンの7つのリジン残基のうちの1つに修飾が起こります。これにより、GGによって修飾されたリジン残基を持つ7つの主要なペプチドのセットが作成され、各トポロジーに固有である(図2)。例えば、K06トポロジーでは、アミノ酸配列の位置6のリジンは、このリジンに114 Daの-GG修飾を加えてトリプシン消化から保護される。
MSによる特定の所定のペプチドの同定は、標的プロテオミクス、またはより具体的には、標的ペプチド獲得10と呼ばれる。使用されている質量分析計の性能に応じて、2つの方法が開発されています。これらは、反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および並列反応モニタリング(PRM)とも呼ばれる選択される。SRM では、前駆体 m/z と製品イオン m/z からなる遷移の選択が行われます。反対に、PRM は前駆体 m/z のみを必要とします。選択後、生成イオンの完全な調査スキャンが行われる。これは、測定11の前に、特定の質量分析計で定量するための適切な生成イオンの選択が不要であるという利点を有する。SRM と PRM の両方を、計測器に応じてスケジュールできます。スケジューリングとは、特定のイオンが分析に含まれる時間枠を割り当てる練習であり、ペプチドはクロマトグラフィーシステムから定義された保持時間で溶出します。特定の時点で尋問されるイオンの数を減らすことは、その時点で予定されているイオンの尋問の頻度を増加させ、したがって、データの精度を向上させます。
一般に、ユビキチントポロジーに対する標的プロテオミクスの適用は、他の標的プロテオミクス実験と同じである。しかし、2つの重要な違いが重要である:まず、ユビキチン鎖の安定性を考慮する必要があります。細胞のリシス時に鎖を急速に分解する複数の強力なデュービキチン化酵素(DUB)があります。ユビキチン特異的プロテアーゼは、チオエステラーゼとメタロプロテアーゼの2つのカテゴリーに分類されます。ユビキチン-ヒドロラーゼのほとんどはチオエステラーゼであり、活性中心にシステイン残基を運ぶ。このシステイン残基をアルキル化することにより、不活性化することができる。したがって、N-エチルマレイミド(NEM)のようなアルキル化剤を含むユビキチン安定化バッファーと高変性化学物質の使用、およびサンプルを冷やして保持することは、分析を成功させるために不可欠です。第2に、他の標的実験とは異なり、ペプチドの選択は固定される。典型的な標的実験では、タンパク質ペプチドを選んで、クロマトグラフィーとイオン化の性能を良好にします。K48のようないくつかのトポロジ特性ペプチドは、これらの特性は良好であるが、他の人にとっては、それらはあまり望ましくない。例えば、典型的な逆相セットアップにおけるK33クロマトグラフィーは、伸伸溶性プロファイルの形成により不良であり、かつK27ペプチドのイオン化特性が悪いため、MS12によってその視認性が低下する。
本プロトコルでは、PRMによる生体試料のユビキチントポロジアセスメントを行う方法について説明する。この手順のサンプルデータは、いくつかの異なる細胞タイプにおけるMG-132阻害剤処理を用いたプロテアソームの摂動を用いて提示される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

プロテオーム内のユビキチン鎖トポロジーのグローバルプロファイルの評価は、幅広い生物学的問題に答える上で興味深いものです。ここで概説するプロトコルは、鎖に組み込まれたユビキチンのトリプティック消化後に残されたジグリシン(-GG)修飾を利用する。これらのトポロジ特性ペプチドを定量化することにより、ユビキチン鎖トポロジーの相対的な存在量を求めることができる。これらのペプチドを並列反応モニタリング実験で定量するために必要なステップは、ユビキチン鎖の安定化を考慮して報告されている。重いコントロール、細胞の分解、および消化の準備は、適切な質量分析計のセットアップとデータ分析のワークフローと共に記述されています。ユビキチントポロジーにおける摂動を伴うデータセットの例は、プロトコルの最適化が結果に与える影響の例を伴って提示される。概説された手順に従うことによって、ユーザーは生物学的文脈の中でユビキチントポロジ景観のグローバル評価を行うことができる。

PRMによるユビキチン鎖分析の使用を実証するために、マウスメラノーマ細胞株B16と2つの一般的なヒト細胞株A549(腺癌性肺胞基底細胞)およびHeLa(子宮頸癌細胞)の3つの細胞株が選択された。これらの培養物は、収穫前に4時間0、10、または100 mM MG-132で処理される前に、適切な培地で中電関数的な相に成長した。MG-132は、プロテアソーム14によるユビキチン共役タンパク質の分解?...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K ビュー.  Luxembourg Institute of Health. この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

生化学

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Rad51 を介した DNA 鎖交換反応のリアルタイム観察

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.