In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

私たちは、ユビキチン系の酵素の遺伝子変異に関連する神経発達障害の分子基盤を定義することに興味を持っています。私たちは、最先端の技術を用いて、これらの酵素によって制御されるシグナル伝達経路を解剖し、遺伝子変異がタンパク質生物学に与える影響を解明しています。この方法の利点は、特定のDUBによって規制される基板に関する事前の知識を必要としない、基板に依存しない手法であることです。

このようにして、神経発達障害に関連する遺伝子分散がDUB触媒活性に与える影響を直接測定し、可能な病原性メカニズムを示唆することができます。ほとんどのDUBの細胞機能は十分に理解されていないため、私たちの研究室では、これらの酵素が媒介するシグナル伝達経路と、遺伝病に関連する遺伝子変異がこれらのプロセスにどのように影響するかを特定することに焦点を当てます。まず、使用直前に20マイクロリットルの化学的に有能なRosetta 2 Escherichia大腸菌細胞を氷上で解凍します。

pGEX6P1 USP27X発現プラスミドを1〜10ナノグラム加え、氷上で5分間インキュベートします。ドライバスで摂氏42度で細胞に30秒間熱ショックを与えます。次に、細胞を氷上で2分間インキュベートします。

80マイクロリットルの室温SOC培地を細胞に加えます。19 mm軌道ベンチトップ温度制御シェーカーで、200 RPM回転で摂氏37度で60分間インキュベートします。次に、50マイクロリットルの培養物をLB寒天プレートにプレートし、クロラムフェニコールとアンピシリンを補充します。

温度制御されたインキュベーターで、蓋を下にして摂氏37度で20時間インキュベートします。形質転換細菌のコロニーを1つ選び、クロラムフェニコールとアンピシリンを添加した10ミリリットルの滅菌LB培地に加えます。前述したように20時間インキュベートします。

次に、クロラムフェニコールとアンピシリンを補給した結核培地1リットルに、10ミリリットルの一晩培養液を加えます。600ナノメートルの光学密度が0.5〜0.6に達するまでインキュベートします。次に、50マイクロモルのイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシドを培養物に添加して発現を誘導します。

サンプルを摂氏16度に冷却した後、摂氏16度で200RPM回転で20時間インキュベートします。次に、細胞を3000G以上、摂氏4度で20分間遠心分離し、発現培養物から細胞をペレット化します。最後に、ペレットを摂氏マイナス80度で少なくとも1時間保管します。

まず、空の重力流柱をレトルトスタンドに固定します。カラムに2〜3ミリリットルのグルタチオンアガロース樹脂を充填し、1リットルの発現培養物から採取した細胞ペレットを精製します。カラムを 20% エタノールの 1 つの樹脂ベッドで洗浄します。

カラムを洗浄した後、セルペレットを摂氏4度で解凍します。解凍したペレットに30ミリリットルのMS500バッファーを加え、端から端まで穏やかに回転させてインキュベートします。次に、溶解した細胞を氷上の50ミリリットルの遠心分離チューブで超音波処理し、ピペットチップから分注したときにライセートが自由に流れるまで超音波処理します。

摂氏 4 度、 20 、 000 G 以上で 30 分間遠心分離し、上清を除去します。次に、上清をビーカーにデカントし、透明化したライセートをカラムにロードします。ライセートを重力流でカラムに流し、フロースルーを収集します。

その後、少なくとも 2 つの樹脂床容量の MS500 洗浄バッファーでカラムを洗浄し、洗浄フロースルーを 5 mL の分画で回収します。次に、各画分1マイクロリットルを100マイクロリットルのBradford試薬に加えて、タンパク質の存在を確認します。MS500 elusion buffer をカラムに通し、5 ミリリットルの溶出画分を回収して、タンパク質を回収します。

タンパク質を沈殿させるには、溶出液に2容量の4モル硫酸アンモニウムを加え、チューブが濁るまでチューブを静かに反転させます。摂氏4度、20、000G以上で30分間遠心分離します。各遠心分離後は、タンパク質ペレットを乱さずに上清を除去してください。

次に、25%グリセロールを添加したMS500バッファーにタンパク質を再溶解してから保存します。精製されたGSTタグ付きUSP27Xを、各脱ユビキチン化酵素の各時点について、10マイクロリットルの精製GSTタグ付きUSP27Xを調製します。ユビキチン鎖を添加する前に、7マイクロリットルのSDS-PAGEローディングバッファーをタイムゼロサンプルに添加して、脱ユビキチン化反応の開始を防ぎます。

各脱ユビキチン化酵素の各時点に、10マイクロリットルの酵素活性化バッファーで希釈した375ナノグラムのK63結合ジユビキチン鎖を添加します。チューブを摂氏30度でインキュベートし、7マイクロリットルのSDS-PAGEローディングバッファーを追加して各時点で停止します。4〜12%グラジエントゲルを使用してSDS-PAGEを実行します。

野生型USP27Xは、1時間のインキュベーション後にK63結合ジユビキチン鎖をモノユビキチンに切断しました。XLID-105関連分散F313V、Y381H、およびS404Nは、1時間のインキュベーション後にK63結合ジユビキチン鎖を切断しませんでした。