ユビキチンの小タンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、細胞内の多くの事象に関与している。本研究は、タンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスに独自の追加を提示します。深いユビキチノメを発見するために濃縮技術と質量分析を使用しています。
ユビキチン化タンパク質由来のdiGlyペプチドの分析を幾つか改善しました。これらには、濃縮前の粗ペプチド分画、およびOrbitrapにおけるより高度なペプチド断片化設定の適用が含まれる。全体として、ユビキチノメのより大きなカバレッジになります。
プロトコルのいくつかの側面は、言葉で記述することは困難です。いくつかの重要なステップの視覚化は、異なるラボで異なるオペレータによってこれらの分析を繰り返すことができるように不可欠です。この手順は、私の研究室の上級技術者であるカレル・ベスタロスティによって実証されます。
実験のために培養細胞またはマウス脳組織を準備することから始めます。細胞を使用する場合は、150センチメートル平方の培養プレートから1つの150センチメートルの2ミリリットルの氷冷、50ミリモルトリスHCL、0.5%デオキシコール酸ナトリウムを含む分解します。95°Cで5分間煮ます。
その後、摂氏4度で10分間超音波処理します。生体内マウス脳組織を使用する場合は、100ミリモルトリスHCL、12ミリモルナトリウムデオキシコール酸12ミリモルモルナトリウム、12ミリモルモルナトリウムN-ラウロイルスカルソシネートを含む氷冷緩衝液でライスする。4°Cで10分間、ライセートを超音波処理します。
その後、摂氏95度で5分間沸騰させます。次に、BCAタンパク質アッセイキットの熱量吸光度を用いて全タンパク量を定量し、これは、正常なdiGlyペプチド免疫沈降のために少なくとも数ミリグラムでなければならない。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1対1の比率で混合します。
5ミリモルDTTですべてのタンパク質を摂氏50度で30分間減らします。そして、その後、暗闇の中で15分間10ミリモルヨウアセトアミドでそれらをアルキル化します。その後、Lys-Cで4時間タンパク質消化を行います。
そして、トリプシン消化は摂氏30度、または室温で一晩。翌日、サンプルを2本のミリリットルエペンドルフチューブに分け、消化されたサンプルにTFAを加え、10,000倍のGで10分間0.5%遠心分離機の最終濃度にして、すべての洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のために上清を含むペプチドを収集する。
高pH逆相C18クロマトグラフィーを使用して、トリプティックペプチドを分画します。約10ミリグラムのタンパク質消化のために0.5グラムの定常相材料で満たされた空の6ミリリットルカラムカートリッジを準備します。準備したカラムにペプチドを積み込み、約10ボリュームの0.1%TFAで洗浄し、続いて10ボリュームの水を洗浄します。
ペプチドを、それぞれ7、13.5、50%アセトニトリルを有する10ミリモルアンモニウムシギマの10カラム量を用いて3つの分数に溶出する。その後、すべての分数を点灯します。タンパク質Aアガロースビーズスラリーに結合したユビキチン残骸モチーフ抗体の1つのバッチは、6等分に分割される。
原稿の方向に従って3つのペプチド画分を溶解し、破片を回転させます。氷の上に他の3つの画分を保ちながら、ビーズスラリーに3つの分数の上澄み物を追加します。そして、回転器ユニット上の摂氏4度で2時間インキュベートします。
次に、ビーズを回転させます。上清を新鮮なビーズのバッチに移します。残りの3つのビーズスラリー画分でインキュベーションを繰り返します。
その後のグローバルプロテオーム解析のために上清を保存します。そして、GFFフィルタープラグを装備した200マイクロリットルピペットチップにビーズを移します。遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5ミリリットルのチューブにチップを入れ、200マイクロリットルの氷冷IAPバッファーでビーズを3回洗浄し、続いて氷冷精製水で3回洗浄します。
200回Gで200倍の柱を回転させ、2分間、カラムを乾燥させないようにします。最終洗浄後、0.15%TFAの50マイクロリットルで2サイクルでペプチドを溶出します。C18段先端でペプチドを脱塩し、真空遠心分離で乾燥させます。
ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。列は原稿の方向に従って設定され、摂氏50度に保たれる。データ依存取得モードで質量分析計を操作します。
4E5の自動ゲイン制御ターゲット設定と50ミリ秒の最大射出時間で、MS1マススペクトルを高解像度で収集します。最も強烈な第 1 モードで質量分析分析を実行し、合計サイクル時間 3 秒の最高速度法を使用します。次に、DDA MS分析の第2ラウンドを最も強い第1モードで行い、低量のペプチドの最適な検出を確実にします。
前駆体イオンを電荷状態とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。そして、以前に尋問された前駆体を60秒間動的に除外します。4重極質量フィルターを 1.6 トムソンの幅に設定したペプチド前駆体を分離します。
その後、最大射出時間50ミリ秒の7E3の自動ゲイン制御でイオントラップ内のMS2スペクトルを収集し、HCD衝突エネルギーを30%にして、アンドロメダ検索エンジンに基づいて自由に利用できるMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant を開き、適切な生データ ファイルを選択します。プロセッサの数を設定し、グループ固有のパラメータタブをクリックします。
消化を選択し、3つの切断を逃すことを可能にします。次に、変更を選択し、変数の変更に diGly を追加します。グローバルパラメータタブを選択し、正しいタンパク質配列データベースを追加します。
他の設定をデフォルトのままにして、start キーを押してデータベース検索を実行します。SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を2に設定し、重いアミノ酸ラベルを選択します。検索が終了したら、テキスト ファイルを Perseus にインポートします。
このプロトコルは、ナノフローLC-MS/MSを用いたdiGlyペプチドを検出することによって、培養細胞およびインビボ材料からタンパク質中のユビキチン化部位を同定するために使用された。既存のプロトコルにいくつかの改良が加えられたため、検出されたdiGlyペプチドの数が多くなりました。免疫沈降前に3つの画分に粗分化を行った。
画分の1つはユビキチン自身のK48修飾トリプティックジグリペプチドを含み、LCクロマトグラムの広いピークを特徴とする。さらに、ペプチド断片化レジームを調整し、LC-MSランをデータ分析手順における最も高い第1および最低の最初の断片化レジーレジーと組み合わせ、4,000個以上のユニークなdiGlyペプチドを生成した。23,000以上のdiGlyペプチドは、プロテアソーム阻害剤で処理されたHeLa細胞の単一サンプルから日常的に同定することができる。
3つの生物学的複製スクリーンで同定されたすべてのdiGlyペプチドのうち、9,000以上が3つの全てに存在し、17,000以上が3つの複製のうち少なくとも2つ中存在していた。ペプチド同定の数は、入力材料の量に非常に依存しています。同定されたdiGlyペプチドの数は出発物質によって期待できますが、これらの数値は推定のみであり、使用される質量分析計の種類にも依存します。
このプロトコルを実施する際には、質量分析ベースのプロテオミクス法と微量サンプル量の取り扱いと分析に関する以前の経験が確実に有利であろう。MaxQuantソフトウェアは、他のデータベース検索アルゴリズムに置き換えることができます。また、異なるタイプの質量分析計を使用してもよい。
ペプチド同定の観点からは結果が若干異なる場合がありますが、これは質量分析法ベースのプロテオミクスアッセイに典型的です。ユビキチンは、媒介タンパク質分解の進行において重要であるが、細胞内の他の多くのプロセスにおいても役割を果たしている。翻訳後修飾としてのユビキチンのより深い知識は、その機能をよりよく理解するために重要です。
