Gostaríamos de agradecer ao laboratório Lee, da Universidade de Minnesota para fornecer o rato espinhal amostras de tecido espinhal que foram usados. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa do ovário Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, pelo Fundo de Investigação e Comunidade Cancer Randy Shaver para MB e pelo Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) para MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

1. Preparação de tampão de lise <ol><li> Dissolve-se a sacarose em água desionizada (Dl) para produzir uma solução stock a 2 M. Filtro de uma solução 2 M de sacarose utilizando um aspirador accionado 0,22 um fluoreto de polivinilideno (PVDF) de filtro. </li><li> Dissolve-se ditiotreitol (DTT) em água desionizada para produzir uma solução stock de 500 mM e armazenar sob condições anaeróbias. Dissolve-se cloreto de magnésio (MgCl2) em água desionizada para produzir uma solução stock de 100 mM. Dissolve-se trifosfato de adenosina (ATP), hidrato de dissódio em água desionizada para produzir uma solução stock de 50 mM. </li><li> Adicione-se uma solução de Tris a pH 7,4 através da dissolução de cloridrato de Trizma em água desionizada e ajustando o pH com hidróxido de sódio (NaOH). </li><li> Combinar porções das soluções de reserva em água Dl para fazer um tampão de lise com uma concentração de sacarose de 250 mM, uma concentração de 1 mM de DTT, uma concentração de MgCl2 5 mM, uma concentração de ATP de 1 mM e uma concentração de 50 mM Tris . Por exemplo, misturar 535,3 ul de Tris, 500 ul de MgCl2, 1,25 mL de sacarose, 20 l de DTT, 200 ul de ATP e 7,4947 ml de água desionizada para tornar 10 ml de tampão de lise. Isto pode ser utilizado para cerca de 20 experiências. </li></ol> 2. Células de cultura para o experimento <ol><li> Adicione meios de alíquotas de 30 ml de DMEM + 10% de soro fetal de bovino (FBS) para um tubo de 50 ml. </li><li> Transferência de células HeLa M17 ou congelados de armazenamento de nitrogênio líquido para um pequeno copo com água morna. </li><li> Transferir as células para o tubo de 50 ml. Primeiro, adicione alguns meios de comunicação para o frasco de celular. Em seguida, transferir as células ressuspensas dentro de 5 segundos de descongelamento. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 450 xg durante 5 minutos para se obter uma pelete de células. Adicionar 20 ml de mídia em um frasco T75. </li><li> Remova a mídia a partir das células usando sucção. Adicionar 5 ml de meio fresco para a pelete de células e ressuspender. </li><li> Transferir a suspensão de 5 ml de células para 20 ml de meio no frasco T75 e incubar a 37 ° C. Change os meios de comunicação a cada 3 dias. </li></ol> Colheita 3. celular <ol><li> Remova a mídia através de sucção, tendo o cuidado de não tocar nas células. </li><li> Lavam-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover PBS utilizando sucção. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para o frasco T75 e incubar a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Adicionar 6 ml de meio fresco ao frasco e voltar a suspender as células. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml e centrifugar a 290 x g durante 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 5 ml de PBS. Bata levemente o fundo do tubo para quebrar o sedimento. Centrifugar a 290 xg durante 5 min. </li><li> Repita o passo 3,6 três vezes. </li><li> Remover PBS e ressuspender as células em 1 ml de PBS fresco. Transferência para o tubo Eppendorf (1,5 ml). Gire a 290 g durante 5 min. </li></ol> 4. Lise Celular <ol><li> Medir o volume aproximado de o sedimento utilizando uma pipeta de umd pesam-se contas de vidro em uma massa: proporção em volume de 1: 1. Adicionar duas vezes o volume da pelota em tampão de lise. Nota: Adicionar o tampão antes de adicionar as contas de vidro. </li><li> Lisar as células no tubo de Eppendorf, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C com vortex numa sala fria. </li><li> Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 seg para resolver os grânulos. Recolhe-se o sobrenadante. </li><li> Adicionar o mesmo volume de contas de vidro como antes para o sobrenadante. </li><li> Vortex, mais uma vez, no máximo de agitação durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar brevemente a 200 xg durante 30 segundos para se estabelecer as esferas de vidro. Recolhe-se o sobrenadante. </li><li> Centrifugar a 5.030 xg durante 5 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas. Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado celular. </li></ol> A homogeneização 5. Tissue <ol><li> Faça uma massa: volume de 1: 9 solução de rato tecido do cordão espinhal de lise. Nota: Este método é aplicável a uma variedade de diferemamostras de tecido ENT. </li><li> Homogeneizar o tecido, utilizando uma configuração de nível 2 no homogeneizador durante 30 segundos para garantir que não existem partes restantes. </li><li> Girar a 5030 xg durante 3 minutos para remover os núcleos, membranas e as células intactas. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante, que é o lisado. </li></ol> 6. Amostra Derivatizaï¿½o <ol><li> Realizar um ácido bicinconínico (BCA) em uma análise de placa de 96 alvéolos para determinar a concentração de proteína de lisado de tecido usando um colorimétrico leitor de placa de 96 poços, tal como especificado pelo protocolo do kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA. </li><li> Trazer uma alíquota correspondente a 20 ug de proteína total de 50 ul usando (DI) de água desionizada. </li><li> Adicionar 2 mL de 1,35 M de sulfona HA-Ub-vinil (VS) para a solução e incubar durante 1 hora a 37 ° C. Isto resulta 20 ug de lisado a 50 nM de sonda na mistura de reacção final. Isto é, em grande excesso molar para assegurar a marcação dos dubs funcionais. </li><li> EUncubate da amostra em tampão de amostra de Laemmli para 5 min a 95 ° C. Para uma reacção de 52 ul de volume de utilização 26 ul de tampão de amostra 2x, 13 ul de tampão de amostra 4x ou 8,87 ul de tampão de amostra de 6x. </li><li> Arrefecer em gelo antes de carregar o gel. </li></ol> 7. Western Blot <ol><li> Carregar um de 12 poços de 4-20% de gel de Tris-glicina com 40 ul de amostra preparada </li><li> Submeter o gel a 95 V até a frente de íon atinge o fundo. </li><li> Realizar uma transferência durante a noite do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). </li><li> Incubar a membrana no amido mancha preta e digitalizar o membane para obter uma imagem que mostra a quantidade de proteína em cada pista. </li><li> Destain a membrana e incubar em 5% de leite em PBS durante 1 h para bloquear. </li><li> Incubar a membrana em que o anticorpo anti-HA primária a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS, quer durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Realize 3 lavagens fou 5 minutos cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente. </li><li> Incubar a membrana de uma peroxidase de rábano rato a uma concentração de 1: 10.000 em leite 5% em PBS durante pelo menos 2 horas. </li><li> Realizar 3 lavagens durante 5 min cada em PBS com 0,1% de Tween-20 em detergente. </li><li> Realize uma lavagem por 5 min em PBS. </li><li> Incubar a membrana de um reagente de detecção quimioluminescente durante 10 min e detecção utilizando um detector de quimioluminescência. Use a configuração de exposição automática no detector. </li></ol>

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Desde ubiquitinação é uma actividade celular fundamental, a compreensão dos mecanismos de regulação poderia ser a chave para desenterrar os processos de doença e patologia. O uso de HA etiquetado local dirigida sondas ativas Ub-derivadas aqui relatados fornece um método fácil, mas altamente aplicável para estudar a degradação de proteínas mediada por Ub. Este método é mais rápido e menos dispendioso do que o estudo de cada uma das dobragens individualmente. Neste método, a l...

O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) serve como uma das principais vias de degradação na célula de mamífero. Substratos ligados à degradação no proteassoma são covalentemente marcados com polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes do substrato alvo entra no proteassoma para a degradação, a etiqueta de poli-ubiquitina deve ser removido. Uma classe de enzimas conhecidas como deubiquitinating enzimas (Dubs) é responsável pela remoção e reciclagem de moléculas de ubiquitina 2. Prevê-se a partir do genoma humano que há quase uma centena de dobragens de trabalho na célula 3. Com um grande número de dubs que controlam processos celulares Ub mediadas tal, estudando estas enzimas apresenta um desafio desde técnicas de mRNA não dão informação sobre a actividade e transferência de western só dá informações sobre os níveis de expressão. A utilização da gripe hemaglutinina (HA) com etiquetas, Ub-derivado local dirigida sondas activas permite uma modificação covalenteficação das dobragens funcionais e, por conseguinte, dá uma visualização directa da actividade destas enzimas sobre um western blot 4. As sondas têm um grupo reactivo tiol C-terminal que serve como um substrato para o suicídio resíduo cisteína local activo 5. Com estas sondas, é possível estudar a expressão e a actividade potencial de muitos dobragens em ambos os estados patológicos e fisiológicos da célula. Alterações na actividade DUB têm sido implicados numa variedade de condições patológicas tais como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, anemia e vários cancros 6-10. Esta técnica fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da doença. No presente trabalho, mostramos a aplicação desta técnica em células HeLa e M17 que foram ligado usando esferas de vidro. Além disso, destacamos como usar esse método em amostras de tecido de rato medula espinhal. A informação obtida a partir desta técnica pode ser usada como um ponto de partida para a identificaçãoalvos terapêuticos, bem como o estabelecimento de modelos para o estudo de diferentes condições de doença. A verdadeira utilidade desta técnica reside na sua capacidade de fornecer informações sobre vários Dubs em um único ensaio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PowerGen 125 ( Homogenizer)</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-261-02P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum-driven filters .22&#181;M&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:119px;">BPV2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid washed &#8804;106&#181;m (~140 U.S. sieve)</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G4649-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S6-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs</td>
			<td style="width:113px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HI FBS</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td>
			<td style="width:113px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">BML-UW0155-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laemmli&#39;s SDS-Sample Buffer (4X, reducing)</td>
			<td style="width:113px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:113px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

O sistema ubiquitina-proteassoma tem sido recentemente implicado em diversas patologias, incluindo as doenças neurodegenerativas e cancro. À luz disto, técnicas para estudar o mecanismo de regulação deste sistema são essenciais para elucidar os processos celulares e moleculares das doenças acima mencionadas. A utilização de sondas derivado de hemaglutinina ubiquitina descritos neste documento serve como uma ferramenta valiosa para o estudo deste sistema. Este artigo detalha um método que permite ao usuário realizar ensaios que dão uma visualização direta do deubiquitinating atividade enzimática. Deubiquitinating controlar a degradação proteossómica e compartilhar homologia funcional em seus sítios ativos, o que permite ao usuário investigar a atividade de várias enzimas em um ensaio. Lysates são obtidos através de suave rompimento celular mecânica e incubadas com o site ativo sondas dirigidas. Enzimas funcionais são marcados com as sondas enquanto enzimas inativos permanecem não ligados. Por prazoNing este ensaio, o utilizador obtém informações sobre a actividade, tanto a expressão e potencial de várias enzimas deubiquitinating de uma maneira fácil e rápida. O método actual é significativamente mais eficiente do que a utilização de anticorpos específicos para os preditos cem enzimas deubiquitinating na célula humana.

As células M17 e HeLa em cultura foram colhidos usando o método detalhado na (de colheita celular 3.) protocolo e do tecido da medula espinal do rato foi obtido. O sedimento de células / tecido da medula espinal foi colocada num tubo com o tampão de lise descrito na secção de preparação do reagente. As pelotas de células foram lisadas usando pérolas de vidro (Figura 1A) e amostras de tecido de ratinho medula espinal foram homogeneizados usando o homogeneizador (Figura 1B). Ap?...

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Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.

Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

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Research

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Biology

9.5K visualizações.  University of Minnesota.  O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos. 