الكتاب أشكر مؤسسة بيل وميليندا غيتس لدعمها لتطوير التكنولوجيا والتدريب.

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول كميات وتركيزات لمدة 96 جيدا لوحة، وشرائط 8-أنبوب، والنظم القائمة على الشعرية (10 ميكرولتر حجم رد الفعل)؛ ومع ذلك، HRM يمكن أيضا أن يؤديها في النظم القائمة على 384 لوحة جيدا مع حجم رد الفعل 5 ميكرولتر عن طريق التوسع كافة وحدات التخزين في المقابل. مجموعة من الكشف عن معظم الأنظمة هو 10 خريج إلى 10 نانوغرام DNA القالب. 1. إعداد قوالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات المتصورة المنجلية مباشرة من الدم تم الحصول عليها من المرضى المشاركين في الدراسات الميدانية وموقع تخزينها والدم كله، وخلايا الدم الحمراء مكعبات، أو على ورق الترشيح. ملاحظة: قد يكون أيضا عينات لتنمو في المختبر تتكيف مع الثقافة؛ ويمكن طلب بعض سلالات مختبر القياسية للتحليل من مركز الموارد للبحث والمراجع الكاشف الملاريا (MR4، يمكن استخدام عينات مباشرة من خلايا الدم الحمراء مكعبات أو الثقافة أو المستخرجة من دم كاملة، وخلايا الدم الحمراء، أو ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي المستخرج منورق الترشيح أو سلالات تتكيف مع الثقافة ملاحظة: إدارة الموارد البشرية حساسة للتركيز الملح. الخلافات تركيز بسبب أساليب استخراج متغير يمكن أن تؤثر بشكل كبير ذوبان درجات الحرارة. في حين مخازن النهائية المحددة ليست عاملا مهما للنجاح، واستخدام معيار مشترك شطف أو إعادة تعليق العازلة (أي الماء، 1X تي [&#39;منخفضة تي &quot;أو&quot; DNA تعليق العازلة &quot;: 10 ملي تريس، الكلور، 0.10 ملي EDTA] أو 1X TE [10 ملي تريس، الكلور، 1 ملم EDTA]) لجميع العينات لتجنب الشاذة أو غير متسقة منحنيات الذوبان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيفات قالب من 10 خريج -10 نانوغرام لكل ميكرولتر في مستوى الشركة المصرية للاتصالات، TE، أو المياه لكل رد فعل 10 ميكرولتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضخيم مباشرة من خلايا الدم الحمراء مكعبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الطفيل خلايا الدم الحمراء باستخدام رقيقة اللطاخة المجهر ملاحظة: تتوفر طرق لتحديد الطفيل خلايا الدم الحمراء المصابة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC): HTTP:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع parasitemias فوق 0.5٪ 1: 400 في PCR الصف المياه، TE، أو الشركة المصرية للاتصالات. استخدام 3 ميكرولتر لكل ميكرولتر رد فعل 5- 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضوابط ملاحظة: إدارة الموارد البشرية يمكن أن تستخدم للمسح الضوئي للكشف عن الجينات تسلسل المتغيرات في عدد سكانها 12؛ ومع ذلك، يتطلب التنميط الجيني دقيقة يجري التحقيق معهم معايير لاحتواء SNP-التحقق من التسلسل. يبني البلازميد أو الملاريا المعزولة مع المورثات المعروفة يمكن استخدامها. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ويستخدم 3D7 (MR4 MRA-151) كجهاز تحكم من النوع البري. بسبب التباين بين التي تديرها، وتشمل دائما الضوابط الإيجابية والسلبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضوابط الإيجابية: إعداد 10 خريج - 10 نانوغرام لكل 1 التخفيفات ميكرولتر من البلازميد أو المعايير مع التحقق من تسلسل المورثات SNP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيطرة السلبية: استخدام PCR المياه الصف كوسيلة لمراقبة أي قالب (NTC) لردود الفعل التضخيم. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط التفاعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب النفط (اختياري) المعدنية. ملاحظة: بعض أنظمة إدارة الموارد البشرية هي منصات ذوبان بذاتها وليس لها غطاء ساخنة لمنع التكثيف والتبخير المنتج خلال التضخيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر الزيوت المعدنية الخفيفة إلى كل لوحة جيدا قبل تحميل خليط التفاعل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10X الأسهم عمل جميع المقايسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى الجدول رقم 1 لالموصى 10X العمل تركيزات الأسهم وكذلك تركيزات النهائية لمقرها منعت مسبار-HRM التنميط الجيني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلائط رد فعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل بئر في لوحة أو أنبوب، إضافة 1 ميكرولتر 10X العمل الأسهم إلى الأمام والاشعال وتحقيقات، 4.0 عكس - 5.0 ميكرولتر 2.5X 2.0X أو HRM مزيج الرئيسي، 1 قالب ميكرولتر، وPCR المياه الصف لحجم رد الفعل الكلي لل10 ميكرولتر . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطانات أو أنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحة الضوئية الصورةeals لتضخيم القائم على لوحة، والقبعات البصرية للأنظمة المستندة إلى قطاع أنبوب، وأغطية بلاستيكية لأنظمة المستندة إلى الشعيرات الدموية. كن على يقين تغطية كاملة والأطباق والقبعات ومختومة تماما وتأمينها لمنع التبخر خلال التضخيم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تدور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات تدور 3 دقائق في 1800 x ج لإزالة فقاعات الهواء وفصل مراحل النفط والمائية إذا تم استخدام الزيوت المعدنية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات رد فعل أو الأنابيب في cycler الحرارية. تشغيل مستوى بروتوكولات منعت مسبار أو مآب التضخيم (الجداول 2 و 3 على التوالي). لاحظ الفرق في درجة الحرارة الصلب بين هذه الأساليب. </li></ol></li></ol> تحليل 3. HRM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد PCR التضخيم، انتقل إلى ذوبان التحليل. لأنظمة ذوبان بذاتها التي ليس لديها المدمج في التضخيم (على سبيل المثال، نظم BioFire الدفاع LightScanner)، وإعادةنقل لوحة تضخيمها من cycler الحرارية ومكان في وثيقة HRM. من واجهة البرنامج نظام، تذوب لوحة 40-80 ° C لإنتاج كل من التحقيق وamplicon قمم ذوبان. ملاحظة: لحفظ ذوبان وتحليل الوقت، يمكن اختصارها في إطار ذوبان لتغطية تتراوح درجة الحرارة لمجرد تحقيق أو المناطق amplicon ذوبان. بعد ذوبان، لوحات وأنابيب يمكن إعادة صهرها إذا لزم الأمر وتخزينها في -20 ° C أو 4 درجات مئوية. أنابيب متجر الزجاج فقط في 4 درجات مئوية لمنع أنابيب من التصدع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ذوبان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات سلبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن برامج التحليل، وترفع من مزيد من عينات التحليل التي لم تضخيم أو التي لها قمم ذوبان خشنة. ملاحظة: بعد اختيار طريقة تحليل لملف التشغيل الفردي، وأداة تلقائيا مجموعة العينات الإيجابية والسلبية. قبل التنميط الجيني كل مجموعة فرعية، يمكن للمستخدم تغيير المكالمات يدويا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما من ذوبانمنحنى أو ذوبان ذروة العرض، انقر بزر الماوس الأيمن على منحنيات المراد إزالتها لتحديدها. بعد اختيار العينات أساء تصنيف، انتقل إلى &quot;مكالمة جديدة&quot;، حدد تجمع المناسب، وانقر فوق &quot;تطبيق التغيير.&quot; </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مشتقات السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة حرارة (-dF / DT) (&#39;المنحنيات الفرق&#39;) نظر، نقل قضبان التطبيع لتطويق التحقيق تذوب المنطقة. ملاحظة: لجنة التحقيق تذوب المنطقة هي انخفاض درجة الحرارة في المناطق ذوبان اثنين. يجب أن تكون قضبان التطبيع في قاعدة القمم تذوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المجموعات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التطبيع، حدد &quot;جماعات حساب&quot; لتعيين تلقائيا العينات إلى مجموعات. عينات إذا لزم الأمر،-تعيين إعادة يدويا إلى مجموعات محددة. ملاحظة: بعض برامج التحليل له عتبات عالية الحساسية التي لا يمكن تغييرها. في هذه الحالات، لياليoftware قد تعيين عينات لمختلف الفئات التي تنتمي بصريا إلى آخر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الأنماط الجينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الأنماط الجينية لكل مجموعة على أساس المعايير (الضوابط الإيجابية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يؤكد المستخدم أن الجماعات المحسوبة صحيحة (إذا لم يكن كذلك، بذلت أن التغييرات الصحيحة تحت علامة التبويب تجميع عن طريق اختيار عينات أساء تصنيف واختيار المجموعة المناسبة من القائمة المنسدلة مربع بجوار &quot;نداء جديد&quot;)، حدد &quot;تحرير أسماء المجموعة &quot;تحت عنوان&quot; التجمع &quot;علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل المورثات من المعايير في مربع ملون المقابلة (على سبيل المثال، إذا 3D7 القياسية لديه المعروف أن النمط الجيني وغير في المجموعة الحمراء، المجموعة الحمراء لديه التركيب الوراثي A). اضغط على &quot;موافق&quot; وانقاذ النتائج. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدعو تصدير الوراثي كجدول بيانات لمزيد من التحليل العينة. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

المستمر HRM خطوة تحليل ما بعد PCR. لذا، عينة وإعداد مقايسة مشابهة لبروتوكولات PCR القياسية، مع إدماج إضافية من صبغة الفلورسنت الإقحام استخدامها لتعقب الانتقال من المزدوج تقطعت بهم السبل على الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل خلال خطوة انصهار عالية الدقة. العامل الوحيد الأكثر أهمية لتحليل HRM الناجح هو منتج قوي PCR. تصميم الاختبار هو المفتاح، وتتوفر العديد من الأدوات الأمثل لتصميم HRM فحص تجاريا والانترنت 13. أطوال Amplicon من 80-150 أزواج قاعدة مع المرافق ~ 20 قاعدة الزوج منعت تحقيقات تركز على SNP أو تعدد الأشكال التي تهم عمل أفضل للتمييز تعدد الأشكال وكذلك النسخ المتنوعة من تعدد الأشكال متعددة داخل المنطقة التحقيق. تحقيقات يمكن أن يكون قد تم حظره باستخدام إما 3 &#39;هل C3 أو الزوج عدم تطابق 2 قاعدة في نهاية 3&#39;، التي تمنع التمديد خلال التضخيم. تحقيقات يمكن أن تكون مصممة لتتناسب مع حبلا قالب واتسون أو كريك. الاختياريعتمد على الاختبارات التجريبية لتحديد أي مسبار تصميم تنتج قمم ذوبان مقبولة. تستخدم الزائدة إلى الأمام أو عكس الاشعال لإنتاج واحد الذين تقطعت بهم السبل المنتج التضخيم التي anneals لتحقيقات المحظورة. إذا كان المسبار يحتوي على تسلسل حبلا إلى الأمام، ثم عكس يستخدم التمهيدي في الزائدة، وعادة في نسبة 1: 5، والعكس بالعكس للتحقيقات التي تطابق حبلا الاتجاه المعاكس. وبالمثل، HRM يعمل بشكل أفضل مع المنتج كافية وقوية PCR. PCR تفاعل الأمثل يتطلب التدرج PCR والاغاروز المواد الهلامية أو تحليل Bioanalyzer لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى. ويمكن زيادة تركيز قالب باستخدام أساليب مثل ما قبل التضخيم، التضخيم المضاعفة متحيز لجميع الأهداف باستخدام تركيز منخفض التمهيدي وأرقام دورة لزيادة تركيز قالب 13. سوى عدد قليل من الأدوات متوافقة مع مآب. الخصائص الحرارية للأنابيب الزجاج الشعيرات الدموية المستخدمة طن هذه الأنظمة تسهل هذه الطريقة. قطر الداخلية صغيرة من الشعيرات الدموية فضلا عن نقل الحرارة السريع من خلال الزجاج توفر التحكم في درجة الحرارة أكثر صرامة من معيار PCR بلستيكور، التي لديها أبطأ معدلات الانتقال بين دورات الصلب وتمسخ بسبب خصائص العزل الحراري من البلاستيك. مع هذا الأسلوب، والحساسيات الكشف يمكن تخفيض 2-5٪ إلى أقل من 1٪ من أليل متحولة في خليط من النوع البري وأليل متحولة 10. HRM هو أداة السطحية وفعالة واقتصادية للSNP التنميط الجيني في مجموعة متنوعة من إعدادات وتطبيقات عديدة، من ترصد الأمراض المعدية إلى المسح الضوئي للمتغيرات جينية السرطان. العديد من الأدوات الأخرى، مثل نانو روش وأنظمة LightCycler (480 و 96) وكذلك منظمة التعاون الاقتصادي في الوقت الحقيقي عرض نظام PCR HRM بالإضافة إلى التضخيم القياسية، في الوقت الحقيقي، وظائف النسخ العدد. باستخدام آلات إنتاجية أعلى، وتكاليف HRM المتوازية ليهالصورة من 0.50 $ لكل فحص في أيدينا، بما في ذلك جميع المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية. في سياق وصفها هنا، تطبيقات ميدانية تسمح المراقبة السكان في الوقت الحقيقي لتغيرات المرتبطة بجهود مكافحة الملاريا، بما في ذلك انخفاض التنوع السكاني، والكشف عن أنواع الطفيليات المستوردة، وظهور وانتشار تعدد الأشكال المرتبطة مع انخفاض حساسية العقاقير. تحسينات على طريقة العرض حساسية إضافية مفيدة للإبلاغ التقدم نحو التخلص من الملاريا والقضاء عليها.

على الرغم من تجدد الاهتمام في مجال مكافحة الملاريا والقضاء، لا تزال الملاريا تشكل عبئا في جميع أنحاء العالم، مع ما يقرب من نصف سكان العالم عرضة لخطر العدوى وأكثر من 550،000 حالة وفاة سنويا، وبخاصة الأطفال في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1. وقد تم دعم هذه البرامج مكافحة واستئصال جديدة من النهضة الجينومية، مع أعداد كبيرة من طفيليات الملاريا التسلسل وتحليلها لالطفرات المرتبطة انخفاض حساسية العقاقير، وزيادة الفوعة، والخصائص السكانية 2،3. الأشكال واحدة النوكليوتيدات (النيوكلوتايد) هي من بين المتغيرات الجينية التي تم تحديدها الأكثر شيوعا 4-7. المحمولة أساليب التنميط الجيني SNP تقدم في الموقع ومراقبة السكان في الوقت الحقيقي وتتبع 8. بالإضافة إلى بصمات الطفيليات الفردية، يتم استخدام &quot;الباركود الجزيئي&quot; أيضا للكشف عن التحولات الزمنية الهائلة في تواتر الصبغياتوكذلك التباين الفعلي حجم السكان وتعقيد إصابة 9. في حين أن هذا مجموعة من المفيد تعدد الأشكال وتتكيف بسهولة مع العديد من المنصات التنميط الجيني، وارتفاع القرار الذوبان (HRM) التحليل بشكل خاص مناسبة تماما للدراسات، حيث التشغيل والكشف عن الطفرات الجديدة بتكاليف منخفضة الحساسة وبسيطة مقارنة التسلسل وميدانية أخرى تستند إلى النهج جذابة في البيئات الفقيرة في الموارد. HRM يبدأ سلسلة من ردود الفعل البلمرة القياسي (PCR) الذي يشتمل على صبغة الفلورسنت. بعد ذوبان PCR تحليل يحدد درجة حرارة الذروة amplicon ذوبان. فرق SNP واحد في amplicon قصيرة يمكن أن يؤدي إلى درجة حرارة كبيرة ذروة الذوبان (TM) الخلافات. العديد من التحسينات على هذه الطريقة توفر أفضل قرار التنميط الجيني للتمييز تعدد الأشكال بما في ذلك الطبقة الرابعة (AT) تعدد الأشكال، وكشف أليل متحولة طفيفة في عينات مع الأليلات متعددة الحالية (polygالتهابات enomic). أولا، المقايسات تتضمن تحقيقات قصيرة طيرانها فوق المنطقة SNP بالإضافة إلى الأمام والاشعال التي تكون موجودة بتركيزات مختلفة عكس. لا تتضخم هذه التحقيقات منعت خلال PCR، ولكن ربط حبلا المنتجة زيادة نظرا لتركيزات التمهيدي غير المتماثلة التي تزيد من إنتاج المنتج التحقيق قالب. هذه amplicons المزدوج تقطعت بهم السبل منفصلة تتكون من التحقيق متجهة إلى القالب حبلا الزائدة هي ~ 20-30 سنة مضت. على طول انخفضت بشكل ملحوظ مقارنة مع amplicon كامل (80-150 بي بي) تؤدي إلى اختلافات تيم أكبر من ذلك بكثير المرتبطة قاعدة واحدة أو متعددة التحقيق قالب عدم التطابق 10. ثانيا، أليل متحولة التضخيم التحيز (مآب) يخفض درجة الحرارة الصلب رد فعل للانحياز رد الفعل تجاه أليل متحولة الحاضرة في نسب منخفضة في التهابات polygenomic. يتم تعيين درجة الحرارة الصلب بين TMS من مطابقة تماما (النوع البري) ومتطابقة (متحولة) التحقيقالصورة. عند هذه الدرجة، الربط من النوع البري أليل غير مستقرة بما فيه الكفاية ما يعوق هذا التضخيم مقارنة بما يعادل عدم تطابق لها، وبالتالي يتحامل التضخيم نحو أليل متحولة عندما كلاهما موجود في عينة واحدة (10). مع هذه التحسينات HRM، وهذه التكنولوجيا قد سمح تتبع أصول وهوية الطفيليات المرتبطة بالعدوى الوباء في أمريكا الجنوبية 11 و الكشف عن الطفرات الجديدة، والتمايز من تعدد الأشكال متعددة تقع مباشرة بجوار بعضها البعض في تسلسل، والطفرات الموجودة في أقل من 1 ٪ من الأليلات في عينات polygenomic 10. زيادة حساسية أهمية خاصة في مناطق الاقتراب الوضع قبل القضاء وأولئك المعرضين للخطر للمقاومة المخدرات الناشئة. القدرة بسرعة وسهولة لتحديد الطفيليات وتعدد الأشكال المستوردة المرتبطة انخفاض حساسية في الموقع بإعلام جهود المراقبة والتحكم عن البرامجفعالية التنفيذ، ويحدد النقاط الساخنة لزيادة جهود القضاء على الملاريا والقضاء عليها. يصف هذا البروتوكول الطرق لحجب مسبار يعمل بنظام ومآب لزيادة حساسية HRM التنميط الجيني.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

على الرغم من عقود من الجهود المبذولة للقضاء، لا يزال الملاريا العبء العالمي. وقد رافق الاهتمام المتجدد الأخيرة في القضاء الإقليمي والعالمي من خلال القضاء على زيادة المعلومات الجينومية عن المتصورة أنواع الطفيليات المسؤولة عن الملاريا، بما في ذلك خصائص السكان الجغرافي وكذلك الاختلافات المرتبطة مع انخفاض الحساسية للأدوية المضادة للملاريا. واحدة الاختلاف الجيني المشترك، تعدد الأشكال وحيدة النوكليوتيدات (النيوكلوتايد)، ويقدم أهدافا جذابة للطفيلي التنميط الجيني. هذه العلامات هي مفيدة ليس فقط لتتبع علامات مقاومة الأدوية ولكن أيضا لتتبع السكان الطفيل باستخدام علامات لا تخضع المخدرات أو الضغوط الانتقائية الأخرى. أساليب التنميط الجيني SNP توفر القدرة على تتبع مقاومة المخدرات وكذلك بصمات الطفيليات الفردية لمراقبة السكان، ولا سيما في استجابة لجهود مكافحة الملاريا في المناطق تقترب eliminatحالة أيون. في حين تم التعرف على تعدد الأشكال بالمعلومات التي الملحد على التكنولوجيات التنميط الجيني محددة، وارتفاع القرار ذوبان (HRM) التحليل دراسات ميدانية لمناسبة خاصة. بالمقارنة مع الطرق قياسية استنادا فلوري مسبار التي تتطلب تعدد الأشكال الفردية في تحقيق واحد وصفت وتقديم حساسية 10٪ في أحسن الأحوال للكشف عن تعدد الأشكال في عينات التي تحتوي على جينات متعددة (polygenomic)، إدارة الموارد البشرية يوفر حساسية 2-5٪. تعديلات على إدارة الموارد البشرية، مثل تحقيقات منعت وتركيزات التمهيدي غير المتماثلة وكذلك تعظيم الاستفادة من درجات الحرارة التضخيم الصلب للانحياز نحو PCR التضخيم من أليل طفيفة، مما يزيد من حساسية HRM. في حين أن تحسين حساسية يعتمد على فحص معين، قمنا بزيادة الحساسيات الكشف إلى أقل من 1٪ من أليل طفيفة. في مناطق الاقتراب القضاء على الملاريا، كشف المبكر عن مقاومة الأدوية المستوردة الناشئة أو أمر أساسي للعلاقات العامةاستجابة ompt. وبالمثل، فإن القدرة على الكشف عن العدوى polygenomic وتفرق أنواع الطفيليات المستوردة من الخزانات المحلية خفي يمكن أن تبلغ برامج المكافحة. تصف هذه المخطوطة تعديلات على التكنولوجيا انصهار عالية الدقة التي زيادة حساسيتها لتحديد العدوى polygenomic في عينات من المرضى.

يمكن تصور البيانات في عدة طرق مختلفة، اعتمادا على برامج التحليل والصك. عادة، مؤامرة من مشتقات السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة حرارة (-dF / DT) ضد نتائج درجة الحرارة الأكثر مباشرة لتصور قمم ذوبان وتحديد الأنماط الجينية. نافذة ذوبان كامل (40 ° C-80 ° C) سيؤدي في كلتا المنطقتين amplicon والتحقيق انصهار الشكل يظهر 1 مثال على قمم ذوبان طبيعية لكلا المنطقتين. وضع إطار التحليل لمجرد نتائج التحقيق المنطقة في تمايز واضح من قمم المقابلة لتعدد الأشكال محددة (الشكل 2). ويظهر تحليل يستند التحقيق بشكل واضح وجود كل من الأليلات كما القمم الفردية مع درجات حرارة انصهار التي تتطابق قمم SNP متماثل (الشكل 3). ويبين الشكل 4 أن progressi<html> الحد vely درجة الحرارة الصلب خلال التضخيم (مآب) النتائج في التحيز لأليل متحولة (الذروة في الجانب الأيسر) (الشكل 4A)، مما أدى إلى زيادة الحساسية للأليل متحولة في عدد سكانها الأليلات مختلطة (الشكل 4B). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> الشكل 1. التحقيق وamplicon ذوبان المناطق. التآمر مشتق السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة الحرارة على مستوى النتائج نافذة ذوبان في كل من المسبار (انخفاض درجة الحرارة) وقمم amplicon ذوبان التي يمكن تحليلها. (مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &gt; <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig2.jpg" /> الشكل 2. التحقيق قمم ذوبان. مباريات الكمال (عادة من النوع البري الأليلات) تؤدي إلى قمم انصهار أعلى (الأحمر)، في حين أن عدم التطابق SNP لها درجات حرارة منخفضة ذوبان (الرمادي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> الشكل 3. Polygenomic ذوبان القمم. عندما تكون موجودة في عينة كل من الأليلات، وتحليل HRM القائم على التحقيق يمثل كل من الأليلات كما المنحنيين الذروة (برتقالي) مع القمم التي تطابق العينات واحدة أليل (الأحمر والرمادي). (مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الخامس</a>ersion من هذا الرقم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> الرقم 4. المسخ أليل التضخيم التحيز (مآب). A. خفض تدريجيا درجة حرارة التضخيم الصلب التحيز الذروة رد فعل ذوبان نحو ذروة المقابلة لمتحولة (انخفاض درجة الحرارة) أليل في عينة polygenomic أو polyallelic. النتائج B. مآب في حساسية HRM للكشف عن الأليلات طفيفة الحاضرة في أقل من 1٪ في عينات polygenomic أو polyallelic. (الجزء B مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الجدول 1. مجموعة المتابعة ارتفاع القرار ردود فعل ذوبان التضخيم القائم على التحقيق. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> حجم في إعادةالعمل (96-جيدا لوحة والأنابيب الشعرية) </td><td> حجم في رد الفعل (384 جيدا لوحة) </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> HRM ميكس ماجستير </td><td> 4-5 ميكرولتر </td><td> 2-2،5 ميكرولتر </td><td> 1 × </td></tr><tr><td> 10 × التمهيدي الزائد </td><td> 1 ميكرولتر </td><td> 0.5 ميكرولتر </td><td> 0.50 ميكرومتر </td></tr><tr><td> 10 × التمهيدي الأخرى </td><td> 1 ميكرولتر </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 ميكرومتر </td></tr><tr><td> 10X التحقيق </td><td> 1 ميكرولتر </td><td> 0.5 ميكرولتر </td><td> 0.40 ميكرومتر </td></tr><tr><td> المياه PCR الصف </td><td> 1-2 ميكرولتر </td><td> 0،5-1 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> DNA قالب </td><td> 1 ميكرولتر </td><td> 0.5 ميكرولتر </td><td> 0،01-10 نانوغرام / ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 10 ميكرولتر </td><td> 5 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. القياسيهعالية الدقة الظروف ذوبان التضخيم د. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> درجة الحرارة </td><td> وقت </td></tr><tr><td> عقد </td><td> 95 درجة مئوية </td><td> 120 ثانية </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 دورات </td><td> 95 درجة مئوية </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 دورة </td><td> 95 درجة مئوية </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> +28 درجة مئوية </td><td> 30 ثانية </td></tr></tbody></table> * هذه هي درجة الحرارة التي تعتمد على amplicon الجدول 3. شروط التضخيم لمتحولة التحيز أليل التضخيم. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> درجة الحرارة </td><td> وقت </td><td> دورات </td><td> معدل المنحدر </td><td> وضع الاستحواذ </td><td> وضع تحليل </td></tr><tr><td> تفسد </td><td> 95 درجة مئوية </td><td> 30 ثانية </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> لا شيء </td&gt; <td> لا شيء </td></tr><tr><td rowspan="2"> دورة </td><td> 95 درجة مئوية </td><td> 2 ثانية </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> لا شيء </td><td rowspan="2"> الكمي </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 ثانية </td><td> 20 </td><td> أعزب </td></tr><tr><td rowspan="3"> ذوبان </td><td> 40 ° C </td><td> 0 ثانية </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> لا شيء </td><td> لا شيء </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 ثانية </td><td rowspan="2"> المستمر </td><td rowspan="2"> ذوبان </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 ثانية </td></tr></tbody></table> * هذه هي درجة الحرارة التي تعتمد على amplicon وسيتم تخفيض عند تنفيذ مآب

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

في حين تحليل عالية الدقة ذوبان يوفر القدرة على التمييز بين الأشكال النووية المنفردة في عدد السكان غير متجانسة، ويمكن أليل متحولة التضخيم التحيز زيادة قدرتها على اكتشاف الأليلات الحالية بنسب منخفضة نسبيا ضمن العينة. يصف هذا البروتوكول التحسينات التي من شأنها تحسين حساسية التحليل ذوبان عالية الدقة.

طرق لزيادة حساسية عالية الدقة ذوبان واحدة النكليوتيد تعدد الأشكال التنميط الجيني في الملاريا

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

methods-to-increase-sensitivity-high-resolution-melting-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Views.  Harvard University.  في حين تحليل عالية الدقة ذوبان يوفر القدرة على التمييز بين الأشكال النووية المنفردة في عدد السكان غير متجانسة، ويمكن أليل متحولة التضخيم التحيز زيادة قدرتها على اكتشاف الأليلات الحالية بنسب منخفضة نسبيا ضمن العينة. يصف هذا البروتوكول الت...

Video: Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

عالية الدقة المجهر الإلكتروني ل<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; CAG النوع الرابع إفراز نظام بيلي المنتجة في ظروف مختلفة من توافر الحديد

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...