המחברים מודים ביל ומלינדה גייטס לתמיכתה של התפתחות טכנולוגיה והכשרה.

הערה: פרוטוקול זה כולל כרכים וריכוזים ל96-גם צלחת, רצועות 8-צינור, ומערכות המבוססות על נימים (10 μl נפח תגובה); עם זאת, יכול גם להתבצע HRM במערכות המבוססת על צלחת 384 גם עם 5 μl נפח תגובה על ידי קנה מידה כל הכרכים בהתאם. מגוון של גילוי עבור רוב המערכות הוא 10 עמ &#39;לתבנית ה- DNA 10 ng. 1. הכינו תבניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות Plasmodium falciparum ישירות מהדם שהתקבל מחולים שהשתתפו במחקרי שדה ואתר מאוחסן ככולו דם, תאי דם אדומים pelleted, או על נייר סינון. הערה: דוגמאות יכולות להיות גם לגדול במבחנה מותאמת תרבות; כמה זני מעבדה סטנדרטיים לניתוח ניתן להזמין ממלרית המחקר ועיון מגיב מרכז משאבים (MR4, ניתן להשתמש בדוגמאות ישירות מתאי דם אדום pelleted או תרבות או מופקים מהדם כל, תאי דם אדומים, או נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה- DNA שחולץ מנייר סינון או זנים מותאמים תרבות הערה: HRM הוא רגיש לריכוז מלח; הבדלי ריכוז בשל שיטות חילוץ משתנים יכולים להשפיע באופן משמעותי לטמפרטורת היתוך. בעוד מאגרים סופיים ספציפיים אינם גורם משמעותי להצלחה, להשתמש חיץ סטנדרטי נפוץ elution או resuspension (כלומר, מים, 1x טה [&#39;טה הנמוך&#39; או &#39;חיץ ההשעיה DNA&#39;: 10 מ&quot;מ טריס-Cl, 0.10 mM EDTA] או 1x TE [10 מ&quot;מ טריס-Cl, 1 mM EDTA]) עבור כל הדגימות כדי למנוע עיקולים להמיס חריגים או בלתי עקביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים תבנית של 10 עמ -10 ng לμl בTe הסטנדרטי, TE, או מים לכל תגובת 10 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברה ישירה מתאי דם אדומים pelleted <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע parasitemia של תאי דם אדומים באמצעות מיקרוסקופ דק למרוח הערה: שיטות לקביעת parasitemia של תאי דם אדומים נגועים זמינות מהמרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל parasitemias מעל 0.5% 1: 400 בכיתת PCR מים, TE, או טה. להשתמש 3 μl לכל תגובת μl 5 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרה הערה: HRM יכול לשמש לסריקה גנטית כדי לזהות רצף גרסאות באוכלוסייה 12; עם זאת, genotyping מדויק דורש החקירה סטנדרטים להכיל SNP-מאומת רצף. בונה או מלריה פלסמיד מבודדת עם ניתן להשתמש גנוטיפים ידועים. עבור מרבית היישומים, 3D7 (MR4 MRA-151) משמש כביקורת wild-type. בשל שונות בין-הטווח, תמיד כוללים בקרות חיוביות ושליליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות חיוביות: הכן 10 עמ &#39;- 10 ng לדילולי 1 μl של פלסמיד או סטנדרטים עם גנוטיפים SNP-מאומת רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה שלילית: מים כיתה השתמש PCR כביקורת לא-תבנית (NTC) לתגובות ההגברה. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת שמן מינרלים (אופציונליים). הערה: מערכות HRM חלקם פלטפורמות היתוך עצמאיות ואין לי מכסה מחומם כדי למנוע עיבוי ואידוי מוצר בהגברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שמן מינרלי אור 20 μl לכל צלחת היטב לפני טעינת תערובת התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x מניות עבודה של כל מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בטבלה 1 ל10x ריכוזים מומלצים לעבוד המניה, כמו גם ריכוזים סופיים לgenotyping HRM מבוסס חסומה-בדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד גם בצלחת או צינור, להוסיף 1 μl 10x עובד המניה קדימה הפוך פריימרים ובדיקות, 4.0 - תערובת 5.0 μl 2.5x או 2.0x HRM ראשי, תבנית μl 1, ומים כיתה PCR עבור הסכום כולל נפח תגובה של 10 μl . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטמי או צינורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש של צלחת אופטיתeals להגברה מבוסס צלחת, כובעים אופטיים למערכות רצועה-מבוססת שפופרת, וכובעי פלסטיק למערכות המבוססות על נימים. הכיסוי בטוח להיות שלם וצלחות וכובעים אטומות לחלוטין ומאובטחים כדי למנוע אידוי בהגברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות ספין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות ספין 3 דקות ב1,800 XG כדי להסיר בועות אוויר ולהפריד שלבי נפט ומימיים אם נעשה שימוש בשמן מינרלים. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות תגובה או צינורות בCycler תרמית. פרוטוקולים סטנדרטיים לרוץ הגברה החסומה-בדיקה או MAAB (לוחות 2 ו -3, בהתאמה). שים לב להבדלים בטמפרטורת חישול בין שיטות אלה. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. HRM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַמִיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההגברה PCR, להמשיך להמסת ניתוח. למערכות עצמאיות היתוך שאינו מובנים בהגברה (למשל., מערכות BioFire ביטחון LightScanner), מחדשלהעביר צלחת מוגברת מCycler תרמית והמקום במכשיר HRM. מממשק תוכנת מערכת, להמס את הצלחת 40-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר שתי פסגות היתוך הבדיקה וamplicon. הערה: כדי לחסוך זמן היתוך וניתוח, חלון ההיתוך יכול להתקצר כדי לכסות טווחי טמפרטורה רק לחקור או אזורי היתוך amplicon. לאחר התכה, יכולים להיות מחדש נמסו צלחות וצינורות במידת צורך ומאוחסן ב -20 ° C או 4 מעלות צלזיוס. צינורות זכוכית חנות רק ב 4 ° C כדי למנוע מצינורות פיצוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח להמיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות שליליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך תוכנת הניתוח, להסיר מדגימות ניתוח נוספות שלא להגביר או שיש לי פסגות משוננות היתוך. שים לב: לאחר בחירת המצב של ניתוח לקובץ הפעלה בודד, המכשיר באופן אוטומטי קבוצות דגימות החיוביות ושליליות. לפני genotyping כל תת-קבוצה, המשתמש יכול לשנות באופן ידני את השיחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משני ההיתוךעקומה או שיא היתוך תצוגה, לחץ לחיצה ימנית על העקומות ליוסרה כדי לבחור אותם. לאחר בחירת הדגימות סווגו כהלכה, ללכת &quot;ניו שיחה,&quot; בחר בקיבוץ המתאים, ולחץ על &quot;החל שינוי.&quot; </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגזר השלילית של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורת תצוגה (-dF / DT) (&quot;Curves הבדל&quot;), להעביר את הברים נורמליזציה להקיף את הבדיקה להמס אזור. הערה: הבדיקה להמס אזור הוא הטמפרטורה נמוכה יותר של אזורי שני ההיתוך. הברים הנורמליזציה צריכים להיות בבסיס של הפסגות להמיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב קבוצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נורמליזציה, להקצות קבוצות חישוב &quot;בחרו באופן אוטומטי דגימות לקבוצות. במידת צורך, מחדש להקצות באופן ידני דגימות לקבוצות ספציפיות. הערה: יש תוכנת ניתוח חלק ספי רגישות גבוהות שלא ניתן לשנות; במקרים אלה, שלoftware עשוי להקצות דגימות לקבוצות שונות שויזואלית שייכת לאחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת גנוטיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת גנוטיפים לכל קבוצה המבוססת על סטנדרטים (בקרות חיוביות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהמשתמש מאשר כי הקבוצות ממוחשבת נכונות (אם לא, כי שינויים נכונים נעשו תחת לשונית הקיבוץ על ידי בחירת דגימות סווגו כהלכה ובחירת הקבוצה הנכונה מתפריט התיבה ליד &quot;ניו שיחה&quot;), בחר באפשרות &quot;שמות קבוצת עריכה &quot;תחת&quot; כרטיסיית הקיבוץ &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את גנוטיפים של הסטנדרטים לתיבה בצבע המתאים (לדוגמא, אם יש 3d7 הסטנדרטי ידוע גנוטיפ והוא בקבוצה האדומה, הקבוצה האדומה יש גנוטיפ). לחץ על &quot;אישור&quot; ולשמור את התוצאות. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות יצוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנוטיפ היצוא קורא כגיליון אלקטרוני לניתוח אוכלוסיית מדגם נוסף. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

רציף HRM הוא צעד ניתוח פוסט-PCR; לכן, לדוגמא והתקנת assay דומה לפרוטוקולים PCR סטנדרטיים, עם שילוב נוסף של צבע intercalating פלורסנט המשמש למעקב אחר המעבר לדנ&quot;א חד-גדילים במהלך שלב ההתכה ברזולוציה הגבוהה פעמיים תקועים. הגורם החשוב ביותר לניתוח HRM מוצלח הוא מוצר PCR חזק. עיצוב assay הוא מפתח, וכמה כלים מותאמים לעיצוב assay HRM זמינים מסחרי והאינטרנט 13. אורכי amplicon של 80-150 זוגות בסיסים עם נלווה ~ 20 זוג בסיס חסום בדיקות מרוכזות על SNP או SNPs עבודת אינטרס להבדיל SNPs כמו גם haplotypes של SNPs מרובה באזור הבדיקה. ניתן לחסום בדיקות או באמצעות &quot;spacer C3 או אי-התאמת 2 בסיס זוג ב3 &#39;3 סוף, המונעת הרחבה בהגברה. יכולות להיות מתוכננות בדיקות כדי להתאים את גדיל התבנית ווטסון או קריק; הבחירהתלוי בבדיקות אמפיריות כדי לקבוע שבדיקת עיצוב מייצרת פסגות היתוך מקובלות. פריימרים עודפים קדימה או לאחור משמשים לייצור מוצר הגברה חד-גדילים שanneals לבדיקות החסומות. אם הבדיקה מכילה את רצף הגדיל קדימה, אז לאחור תחל משמש בעודף, בדרך כלל ביחס של 1: 5, ולהיפך לבדיקות התואמות את הגדיל ההפוך. באופן דומה, HRM עובד הכי טוב עם מוצר ה- PCR מספיק וחזק. אופטימיזציה תגובת PCR דורשת ג&#39;לי PCR וagarose שיפוע או ניתוח Bioanalyzer כדי לקבוע טמפרטורות חישול אופטימליות. ריכוז תבנית יכול להיות מוגבר באמצעות שיטות כגון מראש הגברה, הגברה מרובבת מוטה של כל המטרות באמצעות ריכוז פריימר נמוך ומספרי מחזור להגדיל את ריכוז תבנית 13. רק קומץ של מכשירים תואמים MAAB. תכונות התרמיות של צינורות זכוכית נימים משמשות in מערכות אלה להקל בשיטה זו. הקוטר הקטן הפנים של הנימים כמו גם העברת החום המהירה דרך הזכוכית מציעה בקרת טמפרטורה מחמירה יותר מאשר plasticware PCR הסטנדרטי, שבו יש שיעורי מעבר איטיים בין מחזורי חישול וdenaturation בשל תכונות בידוד התרמית של הפלסטיק. בשיטה זו, ניתן להפחית רגישויות זיהוי בין 2-5% בפחות מ 1% מאלל מוטנטי בתערובת של wild-type ואללים מוטציה 10. HRM הוא כלי קליל, יעיל, וחסכוני עבור genotyping SNP במגוון רחב של הגדרות ויישומים רבים, ממעקב מחלה מדבק לסריקה ולריאנטים גנטיים לסרטן. כמה מכשירים אחרים, כגון ננו רוש ומערכות LightCycler (480 ו -96), כמו גם את הצעת מערכת PCR HRM בזמן אמת אקו בנוסף להגברה סטנדרטית, בזמן אמת, ופונקציונליות עותק-מספר. באמצעות מכונות גבוהה יותר תפוקה, barcoding HRM עולה lesים מ $ 0.50 לכל assay בידיים שלנו, הכולל את כל חומרים כימיים וחומרים מתכלה. בהקשר המתואר כאן, יישומים מבוססים-שדה לאפשר מעקב אוכלוסייה בזמן אמת לשינויים הקשורים למאמצי שליטת מלריה, כוללים מגוון מופחת אוכלוסייה, זיהוי של סוגים מיובאים טפילים, ואת המראה ואת ההתפשטות של SNPs קשור ברגישות תרופה מופחתת. חידודים לשיטה להציע רגישות נוספת שימושית עבור ליידע התקדמות לקראת חיסול מלריה ומיגור.

למרות התעניינות מחודשת בשליטת מלריה ומיגור, מלריה נשארה נטל בעולם, עם כמעט מחצית מאוכלוסיית העולם של בסיכון לזיהום ויותר מ 550,000 מקרי מוות בשנה, ילדים במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה 1. תוכניות בקרה ומיגור החדשות אלה נתמכים על ידי הרנסנס הגנומי, עם מספר גדול של טפילי מלריה רצף וניתחו למוטציות הקשורות לרגישות מופחתת סמים, אלימות מוגברת, ולמאפייני אוכלוסייה 2,3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs) הוא בין וריאנטים הגנטיים הנפוצה ביותר שזוהו 4-7. שיטות genotyping SNP ניידים מציעות באתר ומעקב אוכלוסייה בזמן אמת ומעקב 8. בנוסף לטביעת אצבע טפילים בודדים, &quot;ברקוד המולקולרי &#39;משמש גם לזהות שינויים זמניים דרמטיים בתדירות אללכמו גם גודל שונות יעיל אוכלוסייה ומורכבות של זיהום 9. בעוד זו קבוצה של SNPs אינפורמטיבי מותאמת בקלות לפלטפורמות genotyping רבות, ברזולוציה גבוהה נמסה (HRM) הניתוח מתאים במיוחד היטב לשדה מבוסס מחקרים, שבו פעולה וזיהוי של מוטציות רומן בעלויות נמוכות רגישות ופשוטה בהשוואה לרצף ואחר גישות הן אטרקטיביות בהגדרות משאבים לעניים. HRM מתחיל עם תגובת פולימראז הסטנדרטי שרשרת (PCR) שמשלב צבע ניאון. ההודעה-PCR ניתוח המסת קובע את טמפרטורת התכת amplicon שיא; הבדל יחיד SNP בamplicon קצר יכול לגרום לטמפרטורת התכת שיא המשמעותית הבדלים (TM). כמה חידודים לשיטה זו מציעים רזולוציה genotyping טוב יותר להבחין SNPs כולל בכיתה ד (AT) SNPs, ולזהות אללים מוטציה קלים בדגימות עם אללים מרובים הנוכחיים (polygזיהומי enomic). ראשית, מבחני לשלב בדיקות קצרות מרוכזות על אזור SNP בנוסף לקדימה הפוך פריימרים שנמצאים בריכוזים שונים. בדיקות אלה אינן חסומים מוגברים במהלך PCR, אבל להיקשר לגדיל מיוצר בעודף עקב ריכוזי פריימר סימטריים שלהגדיל את הייצור של מוצר הבדיקה התבנית. amplicons פעמיים תקועים הנפרד אלה בהיקף של הבדיקה קשורה לגדיל התבנית העודף הן ~ 20-30 נ&quot;ב; שלהם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לאורך כל amplicon העופרת (80-150 נ&quot;ב) להבדלי Tm הרבה יותר גדולים הקשורים לבדיקת תבנית בסיס בודד או מרובה חוסר ההתאמה 10. שנית, ההטיה אלל מוטנטי הגברה (MAAB) מורידה את טמפרטורת חישול התגובה להטיה כלפי תגובת אללים מוטציה הנוכחיות ביחסים נמוכים בזיהומי polygenomic. חישול בטמפרטורה מוגדרת בין Tms של התאמה מושלמת (wild-type) והבדיקה תואמת (מוטציה)ים. בטמפרטורה זו, מחייב אלל wild-type הוא יציב מספיק ההגברה שמתעכבת בהשוואה למקבילתה אי התאמה, ובכך הטיית ההגברה לאלל מוטנטי כאשר שניהם נמצאים במדגם יחיד 10. עם חידודי HRM אלה, טכנולוגיה זו אפשרה מעקב של מקורות וזהות של טפילים הקשורים זיהומי מגיפה בדרום אמריקה 11 וזיהוי של מוטציות חדשות, בידול של SNPs מרובה ממוקם מייד ליד שני ברצף, ומוטציות קיימים בפחות מ 1 % מאללים בדגימות polygenomic 10. רגישות מוגברת היא חשובה במיוחד באזורים מתקרבים מצב טרום-חיסול ואלו בסיכון לעמידות לתרופות מתעוררים. היכולת לזהות במהירות ובקלות טפילים מיובאים וSNPs קשורים ברגישות מופחתת באתר מודיעה מאמצי מעקב ותוכניות בקרה עלהיעילות של היישומים שלהם ונקודות חמות מזהה למאמצי מיגור מלריה וחיסול מוגברים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחסומות-בדיקה מבוססת וMAAB לרגישות genotyping HRM מוגבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

למרות עשרות שנים של מאמצי מיגור, מלריה נשארה נטל עולמי. עניין מחודש אחרון בחיסול אזורי ומיגור הגלובלי כבר מלווה במידע גנומי עלה על מיני Plasmodium טפיל מלריה אחראים ל, כוללים מאפיינים של אוכלוסיות גיאוגרפיות כמו גם וריאציות הקשורים רגישות מופחתת לתרופות נגד מלריה. וריאציה אחת משותפת גנטית, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs), מציעה יעדים אטרקטיביים לgenotyping טפיל. סמנים אלה הם שימושיים לא רק למעקב אחר סמני עמידות לתרופות, אלא גם למעקב אחר אוכלוסיות טפילות באמצעות סמנים לא תחת סמים או לחצים סלקטיביים אחרים. שיטות genotyping SNP מציעות את היכולת לעקוב אחר עמידות לתרופות, כמו גם לטביעות אצבעות טפילי פרט למעקב אוכלוסייה, במיוחד בתגובה למאמצי שליטת מלריה באזורים מתקרבים eliminatמעמד יון. בעוד SNPs אינפורמטיבי זוהה כי הם אגנוסטי לטכנולוגיות genotyping ספציפיים, ניתוח ברזולוציה גבוהה נמס (HRM) מתאים במיוחד מחקרים מבוססי שדה. בהשוואה לשיטות ניאון בדיקה סטנדרטית מבוססות הדורשות SNPs הבודד בבדיקה שכותרתו יחידה ומציעים רגישות במקרה הטוב 10% כדי לזהות SNPs בדגימות המכילות גנומים מרובים (polygenomic), HRM מציע רגישות 2-5%. שינויים HRM, כגון בדיקות חסומות וריכוזי פריימר סימטריים כמו גם אופטימיזציה של טמפרטורות חישול הגברה להטיה כלפי PCR הגברה של אלל הקטין, להגביר עוד יותר את הרגישות של HRM. בעוד שיפור הרגישות תלוי בassay הספציפי, הגדלנו רגישויות זיהוי פחות מ 1% מאלל הקטין. באזורים מתקרבים מיגור מלריה, גילוי המוקדם של מתעוררים או עמידות לתרופות מיובאות הוא חיוני ליחסי ציבורתגובת ompt. כמו כן, את היכולת לזהות זיהומי polygenomic ולהבדיל סוגים טפילים מיובאים ממאגרים מקומיים נסתרים יכולה להודיע ​​תוכניות בקרה. כתב יד זה מתאר שינויים טכנולוגית התכה ברזולוציה גבוהה המגבירים עוד יותר את הרגישות שלו לזהות זיהומי polygenomic בדגימות מטופל.

ניתן דמיינו נתונים במספר דרכים שונות, בהתאם לתוכנת הניתוח והמכשיר. בדרך כלל, עלילה של הנגזר השלילי של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורה (-dF / DT) נגד תוצאות טמפרטורה היא פשוטה ביותר המאפשר הדמיה פסגות היתוך וקביעת גנוטיפים. חלון התכה מלא (40 ° C-80 ° C) יגרום לשני אזורי amplicon והתכת בדיקה. איור 1 מציג דוגמא של פסגות היתוך מנורמלות לשני האזורים. הגדרת חלון הניתוח רק את תוצאות בדיקה באזור בידול ברור של הפסגות המתאימות SNPs הספציפי (איור 2). ניתוח מבוסס בדיקה מראה בבירור את נוכחותם של שני אללים כמו פסגות בודדות עם טמפרטורות התכה התואמות את הפסגות הומוזיגוטים SNP (איור 3). איור 4 מראה progressi ש<html> vely הפחתת טמפרטורת חישול בהגברת תוצאות (MAAB) בהטיה כלפי אלל מוטנטי (השיא בצד שמאל) (איור 4 א), וכתוצאה מכך הרגישות מוגברת לאלל מוטנטי באוכלוסייה של אללים מעורבים (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 1. אזורי איור בדיקה והתכת amplicon. שרטוט הנגזר השלילית של הקרינה המנורמלת ביחס לטמפרטורה מעל תוצאות חלון היתוך רחבות בשתי הבדיקה (הטמפרטורה נמוכה יותר) ופסגות היתוך amplicon שניתן לנתח. (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig2.jpg" /> פסגות איור 2. בדיקה היתוך. התאמות מושלמת (בדרך כלל אללים wild-type) לגרום לפסגות גבוהות יותר התכה (אדום), בעוד שחוסר ההתאמה SNP טמפרטורות התכה נמוכות (אפורות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> איור 3. Polygenomic נמס פסגות. כאשר שני אללים נמצאים במדגם, ניתוח HRM מבוסס בדיקה מייצג שני אללים כמו עקומות שני-שיא (כתום) עם פסגות התואמות את הדגימות בודדות אלל (אדום ואפור). (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בV גדול יותר</a>ersion של נתון זה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> איור 4. הטיה ההגברה אלל מוטנטי (MAAB). א בהדרגה הורדת טמפרטורת חישול ההגברה הטיות תגובת שיא ההיתוך לשיא מקביל לאלל מוטנטי (טמפרטורה נמוכה יותר) במדגם polygenomic או polyallelic. ב MAAB תוצאות ברגישות HRM כדי לזהות אללים קטין נוכחים בפחות מ -1% בדגימות polygenomic או polyallelic. (חלק ב &#39;מותאם מדניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הטבלה 1. סט-אפ של תגובות הגברה היתוך ברזולוציה גבוהה המבוסס על בדיקה. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רְכִיב </td><td> נפח למחדשפעולה (96-גם צלחת וצינור נימים) </td><td> נפח לכל תגובה (384 גם צלחת) </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> HRM מיקס מאסטר </td><td> 4-5 μl </td><td> 2-2.5 μl </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x פריימר העודף </td><td> 1 μl </td><td> 0.5 μl </td><td> 0.50 מיקרומטר </td></tr><tr><td> 10 x פריימר אחר </td><td> 1 μl </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 מיקרומטר </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 μl </td><td> 0.5 μl </td><td> 0.40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מים בדרגת PCR </td><td> 1-2 μl </td><td> 0.5-1 μl </td><td></td></tr><tr><td> תבנית ה- DNA </td><td> 1 μl </td><td> 0.5 μl </td><td> .01-10 Ng / μl </td></tr><tr><td></td><td> 10 μl </td><td> 5 μl </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2. standarתנאי הגברה היתוך ד ברזולוציה גבוהה. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td></tr><tr><td> לְהַחזִיק </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 120 שניות </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 מחזורים </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> C ° 68 * </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td rowspan="2"> מחזור 1 </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> 28 מעלות צלזיוס </td><td> 30 שניות </td></tr></tbody></table> * טמפרטורה זו היא amplicon תלוי טבלה 3. תנאי הגברה להטית ההגברה אלל מוטנטי. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td><td> שיעור רמפה </td><td> מצב רכישה </td><td> מצב ניתוח </td></tr><tr><td> לְפַגֵל </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 30 שניות </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> אַף לֹא אֶחָד </td&gt; <td> אַף לֹא אֶחָד </td></tr><tr><td rowspan="2"> מַחזוֹר </td><td> 95 מעלות צלזיוס </td><td> 2 שניות </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> אַף לֹא אֶחָד </td><td rowspan="2"> קְבִיעַת כָּמוּת </td></tr><tr><td> C ° 56 * </td><td> 15 שניות </td><td> 20 </td><td> אֶחָד </td></tr><tr><td rowspan="3"> לְהַמִיס </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td><td> 0 שניות </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> אַף לֹא אֶחָד </td><td> אַף לֹא אֶחָד </td></tr><tr><td> C ° 45 * </td><td> 0 שניות </td><td rowspan="2"> רציף </td><td rowspan="2"> לְהַמִיס </td></tr><tr><td> C ° 90 * </td><td> 0 שניות </td></tr></tbody></table> * טמפרטורה זו היא amplicon תלוי ותופחת בעת ביצוע MAAB

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המשפרים את הרגישות של ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה.

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

methods-to-increase-sensitivity-high-resolution-melting-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Views.  Harvard University.  בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המש?...

Video: Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

שתי שיטות של גיבוש Heterokaryon לגלות גורמים הגבלת HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...