Yazarlar teknoloji geliştirme ve eğitim verdiği destek için Bill ve Melinda Gates Vakfı&#39;na teşekkür ediyorum.

Not: Bu protokol, 96 oyuklu bir plaka, 8 borulu şeritler ve kılcal tabanlı sistemler (10 ul reaksiyon hacmi) için miktarlar ve konsantrasyonlarda içerir; Bununla birlikte, İK ayrıca buna uygun olarak, tüm miktarlar ölçekleme ile 5 ul reaksiyon hacmi 384 oyuklu plaka bazlı sistemlerde gerçekleştirilebilir. Çoğu sistemler için algılama aralığı 10 ng şablon DNA 10 pg olduğunu. 1. Şablonları hazırlayın <ol><li> Kan alan yeri çalışmalara katılan hastalardan elde edilen ve bütün kan gibi saklanan topak kırmızı kan hücreleri ya da filtre kağıdı üzerinde şirketinden Plasmodium falciparum örnekleri elde edilir. Not: Numuneler, aynı zamanda, kültür adapte in vitro büyümesi olabilir; Analiz için bazı standart laboratuar suşları, Sıtma Araştırma ve Referans Reaktif Resource Center (MR4 sipariş edilebilir, Örnekler topak kırmızı kan hücreleri veya kültüründen direkt olarak kullanılabilir ya da bütün kan, kırmızı kan hücreleri, ya da filtre kağıdı elde edilebilir. </li><li> DNA, elde edilenFiltre kağıdı veya kültür adapte suşlar Not: İK tuz konsantrasyonunda karşı duyarlıdır; nedeniyle değişken emme yöntemleri konsantrasyon farklılıkları belirgin erime sıcaklıkları etkileyebilir. Belirli nihai tamponlar başarı için önemli bir faktör olmasa da, standart bir ortak elüsyon veya tabanda tampon (yani, su, 1x Te [&#39;düşük Te&#39; veya &#39;DNA süspansiyon tamponu&#39;: 10 mM Tris-Cl, 0.10 mM EDTA] kullanın veya 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) Tüm numuneler anormal veya tutarsız eriyik eğrileri engellemek için. <ol><li> Şablonu dilüe 10 pg -10 ng başına ul standart Te, TE, ya da su her 10 ul reaksiyon için. </li></ol></li><li> Peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin doğrudan büyütme <ol><li> Ince smear mikroskopi kullanılarak kırmızı kan hücrelerinin parasitemia belirleyin Not: Enfekte kırmızı kan hücrelerinin parasitemia saptanması için yöntemler Hastalık Kontrol ve Önleme (CDC) Merkezleri edinilebilir: http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> % 0.5 1 Yukarıdaki parasitemias seyreltin: 400 PCR sınıf su, TE, veya Te. Her bir 5 ila 10 ul reaksiyon için 3 ul kullanabilir. </li></ol></li><li> Kontroller Not: İK sekansı, bir popülasyonda 12 varyantları saptamak için, gen tarama için de kullanılabilir; Ancak, doğru genotipleme standartları dizisi doğrulanmış SNP içeren ifadeleri alındıktan gerektirir. Bilinen genotipleri kullanılabilir plazmid yapıları veya sıtma ayırır. Çoğu uygulama için, 3D7 (MR4 MRA-151), vahşi tip bir kontrol olarak kullanılır. Nedeniyle arası vadede değişkenliği, her zaman pozitif ve negatif kontrolleri içerir. <ol><li> Pozitif kontroller: - dizi-doğrulanmış SNP genotipleri ile 1 ul plazmid dilüsyonları veya standartlara göre 10 ng 10 pg hazırlayın. </li><li> Amplifikasyon reaksiyonları için no-şablon kontrolü (NTC) olarak kullanın PCR sınıf su: Negatif kontrol. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR Amplifikasyonu <ol><li> Reaksiyon karışımı hazırlayın <ol><li> (İsteğe bağlı) Madeni yağ kaplaması. Not: Bazı HRM sistemleri bağımsız erime platformları ve amplifikasyon sırasında yoğuşma ve ürün buharlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapak yok. <ol><li> Reaksiyon karışımı yüklemeden önce her plaka 20 ul hafif mineral yağı ekleyin. </li></ol></li><li> Tüm deneyler 10x çalışma stokları hazırlayın <ol><li> Tavsiye 10x çalışma stok konsantrasyonları yanı sıra bloke prob tabanlı HRM genotipleme için nihai konsantrasyonlar için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> Reaksiyon karışımlarını hazırlayın <ol><li> Plaka ya da boru içinde her birine, ileri çalışma stok 1 ul 10x ekleme ve primerler ve problar, 4,0 - ters 10 ul bir toplam reaksiyon hacmi 5.0 ul 2.5 x 2.0 x veya İK ana karışımı, 1 ul şablonu ve PCR dereceli su . </li></ol></li><li> Kapak plakaları veya tüpler <ol><li> Optik plaka s kullanınkılcal tabanlı sistemler için plaka bazlı amplifikasyon için eals, şerit boru tabanlı sistemler için optik kapaklar ve plastik kapaklar. Be emin kapsamı tamamlandı ve levhalar, kapaklar tamamen kapalı ve yükseltme sırasında buharlaşmasını önlemek için şifrelenmektedir. </li></ol></li><li> Spin örnekleri <ol><li> Spin plakalar 1800 x g&#39;de 3 dakika hava kabarcıklarını çıkarmak için ve mineral yağı kullanılırsa, yağ ve sulu fazlar ayrıldı. </li></ol></li></ol></li><li> Amplifikasyon protokolü <ol><li> Termal döngü reaksiyon plakaları veya tüp yerleştirin. Run standart bloke sonda veya MAAB amplifikasyon protokolleri (Tablo sırasıyla 2 ve 3). Bu yöntemler arasında, tavlama sıcaklık farkı dikkat edin. </li></ol></li></ol> 3. HRM Analizi <ol><li> Eriyik <ol><li> PCR amplifikasyonu sonra, analiz erime devam edin. Yerleşik olmayan amplifikasyon bağımsız erime sistemleri (örneğin., BIOFIRE Savunma LightScanner sistemleri) için yenidenİK alet termal döngü cihazı ve yerden yükseltilmiş plaka hareket ettirin. Hem prob ve amplikon eritme doruklarına üretmek için 80 ° C - sistem yazılım arayüzünde, 40 plaka eritebilir. Not: erime ve analiz zamandan tasarruf etmek için, erime pencere sadece soruşturma veya amplikon erime bölgeleri için sıcaklık aralıklarını kapsayacak şekilde kısaltılabilir. Gerekli ve -20 ° C ya da 4 ° C &#39;de muhafaza edildiğinde erimesinden sonra, plakalar ve tüpler yeniden eritilebilir. Sadece 4 ° C&#39;de saklayın cam borular çatlama tüpleri önlemek için. </li></ol></li><li> Erime analizi <ol><li> Negatif örnekleri kaldır <ol><li> Analiz yazılımı içinde, yükseltmek ya da pürüzlü erime zirveleri yoktu ileri analiz örnekleri çıkarın. Not: Tek bir çalışma dosyası için analiz modunu seçtikten sonra, cihaz otomatik olarak gruplar olumlu ve olumsuz örnekleri. Her alt kümesini genotiplenmesi önce, kullanıcı el aramaları değiştirebilir. <ol><li> Ya erimesinieğri ya da erime zirvesi görünümü, eğriler sağ tıklayın seçmek için kaldırılacak. Sınıflandırılmamış örnekleri seçtikten sonra, &quot;Yeni Çağrı,&quot; uygun gruplama seçin ve tıklayın gidin &quot;Değiştir uygulayın.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> Normalleştirmek <ol><li> Sıcaklıkta (-df / dT) (&#39;Fark Eğrileri&#39;) görünümü açısından normalize floresan negatif türevi, bölgeyi eritmek probu çevreleyen normalleştirme çubuklarını hareket ettirin. Not: Prob bölgesi iki erime sıcaklığı bölgelerinin düşük bir sıcaklık eriyik. Normalizasyon çubukları eriyik tepe tabanında olmalıdır. </li></ol></li><li> Grupları hesaplayın <ol><li> Normalleşme sonra, seçin &#39;Hesapla grupları&#39; otomatik gruplara örnekleri atamak. Gerekirse, elle belirli gruplara örnekler atamalı yeniden. Not: Bazı analiz yazılımı değiştirilemez yüksek hassasiyet eşiklerini vardır; bu gibi durumlarda, software görsel başka ait farklı gruplara örnekleri atayabilirsiniz. </li></ol></li><li> Genotipleri atama <ol><li> Standartlara (pozitif kontroller) dayalı her bir grup için genotipleri atayın. <ol><li> (Ki doğru değişiklikler Sınıflandırılmamış örnekleri seçerek ve &quot;Yeni Arama&quot; yanındaki açılan kutudan doğru grubunu seçerek gruplandırma sekmesi altında yapılmış değilse) kullanıcı hesaplanan gruplar doğru olduğunu teyit sonra &quot;Edit Grubu Adları seçin Gruplama &quot;sekmesi&quot; altında &quot;. </li><li> İlgili renkli kutunun içine standartların genotipleri girin (standart 3D7 bilinen bir genotipi vardır ve kırmızı grupta ise, örneğin, kırmızı grup genotip A vardır). &quot;OK&quot; tuşuna ve sonuçları kaydedin. </li></ol></li></ol></li><li> İhracat sonuçları <ol><li> İhracat genotipi daha örnek popülasyon analiz için bir elektronik tablo olarak çağırır. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sürekli HRM bir post-PCR analizi adımdır; Bu nedenle, numune ve deney kurulumu geçişi izlemek için kullanılan bir fluoresan araya eklenen boyanın ilave dahil edilmesi ile, standart PCR protokollerine benzer çift kollu yüksek çözünürlüklü eritme aşaması sırasında, tek-şeritli DNA&#39;ya bağlanır. Başarılı HRM analizi için tek ve en önemli faktör sağlam bir PCR ürünüdür. Tahlil tasarım anahtarıdır ve HRM tahlil tasarımı için optimize edilmiş çeşitli araçlar, ticari ve çevrimiçi 13 mevcuttur. ~ 20 baz çifti eşliğinde 80-150 baz çifti amplikon uzunlukları sonda bölgede SNP yanı sıra birden fazla SNP haplotipleri ayırt etmek SNP veya ilgi işin en iyi SNP üzerine merkezli problar engelledi. Sondalar, bir 3 &#39;C3 ara parçası veya 3 bir baz çifti uyuşmazlığı 2&#39;, amplifikasyon sırasında uzantısı bilmek sonunda kullanılarak bloke edilebilir. Sondalar Watson ve Crick&#39;in template şeridini eşleştirmek için dizayn edilebilir; seçimkabul edilebilir erime zirveleri üreten prob tasarımı belirlemek için deneysel testler bağlıdır. İleri ya da geri primerler Aşırı problar bloke tavlanan tek sarmallı amplifikasyon ürünü üretmek için kullanılır. Prob ileri şeridi dizisi içeriyorsa, o zaman, primer fazla kullanılan tersine tipik olarak, 1: 5 oranında ve ters iplikçik eşleşen problar için tam tersi. Benzer şekilde, HRM yeterli ve sağlam PCR ürünü en iyi şekilde çalışır. PCR reaksiyon optimizasyonu optimum tavlama belirlemek için degrade PCR ve agaroz jeller veya Bioanalyzer analiz gerektirir. Şablon konsantrasyonu, ön amplifikasyon, şablon konsantrasyonunun 13 geliştirmek için, düşük primer konsantrasyonu ve döngü sayıları kullanarak tüm hedeflerin yanlı çoğaltılmış çok katlı amplifikasyon gibi yöntemler kullanılarak arttırılabilir. Araçların sadece bir avuç MAAB ile uyumludur. Cam kapilerleri tüplerin ısıl özellikleri i kullanılırn bu sistemler, bu yöntem kolaylaştırır. Kılcalların, küçük iç çapı, yanı sıra cam yoluyla hızlı bir ısı transferi plastik termal izolasyon özellikleri nedeniyle, tavlama ve denatürasyon döngüleri arasında yavaş bir geçiş oranına sahip standart PCR plasticware, daha sıkı bir sıcaklık kontrolü vardır. Bu yöntem ile, algılama hassasiyeti, yabani tip ve mutant alelleri 10 oluşan bir karışım içinde, bir mutant alelinin az% 1 2-5 ile% azaltılabilir. HRM kanser gen varyantları için tarama bulaşıcı hastalık gözetim gelen ayarları ve birçok uygulama çeşitli SNP genotipleme için, basit, verimli ve ekonomik bir araçtır. Böyle Roche Nano ve LightCycler sistemleri (480 ve 96) yanı sıra standart büyütme, gerçek zamanlı ve kopya numarası işlevselliğine ek olarak Eko Real-time PCR sistemi teklif İKY gibi çeşitli diğer enstrümanlar. Yüksek verim makineleri kullanarak, HRM barkod maliyeti lesTüm reaktifler ve sarf malzemeleri dahil olmak üzere elinde deney başına 0,50 $, daha s. Burada anlatılan bağlamda, alan bazlı uygulamalar azaltılmış nüfus çeşitliliği, ithal parazit türlerinin tespiti ve azaltılmış ilaç duyarlılığı ile ilişkili SNP görünüm ve yayılma dahil sıtma kontrolü çabaları ile ilişkili değişiklikler için gerçek zamanlı nüfus gözetimi sağlar. Yöntemi Ayrıntılandırmalar sıtma ortadan kaldırılması ve eradikasyon doğru ilerlemeyi bilgilendirdiğiniz için kullanışlı ek hassasiyeti sunuyoruz.

Sıtma kontrol ve eradikasyon yenilenen ilgiye rağmen, sıtma neredeyse enfeksiyon riski dünya nüfusunun yarısı ve yıllık en fazla 550.000 ölüm, Sahra-altı Afrika&#39;da 1 özellikle çocuklarla, dünya çapında bir yük olmaya devam etmektedir. Bu yeni kontrol ve eradikasyon programlarının azaltılmış ilaç duyarlılığı ile ilişkili mutasyonlar için sıralı ve analiz sıtma parazitlerinin çok sayıda artmış virülans ile, genomik rönesans tarafından desteklenen ve nüfus özellikleri 2,3 için oylandı. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) en yaygın tanımlanan genetik varyantlar 4-7 arasındadır. Taşınabilir SNP genotipleme yöntemleri yerinde ve gerçek zamanlı nüfus gözetim ve 8 izleme sunuyoruz. Tek tek parazitlerin izini ek olarak, &quot;moleküler barkod &#39;de alel sıklığı dramatik zamansal kaymalarını belirlemek için kullanılırhem de varyans etkili nüfus büyüklüğü ve enfeksiyon 9 karmaşıklığı olarak. Bilgilendirici SNP bu seti kolayca birçok genotipleme platformlara adapte edilirken, yüksek çözünürlüklü (HRM) analizi, özellikle hassas ve kolay kullanım ve düşük maliyetlerle yeni mutasyonların tespit sıralama ve diğer karşılaştırıldığında çalışmaları, dayalı alana çok uygundur eritme yaklaşımlar kaynak fakiri ortamlarda caziptir. İK, bir floresan boya içeren standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başlar. Post-PCR eritme analiz zirve amplikon erime sıcaklığına belirler; Kısa bir amplikon tek bir SNP farkı önemli zirve erime sıcaklığı (Tm) farklılıklara sebep olabilir. Bu yöntemin çeşitli iyileştirmeler (mevcut çoklu alleller ile numunelerde polyg minör mutant allel sınıf IV (AT) SNP de dahil olmak üzere SNP farklılaştırmak ve tespit etmek için daha Genotipleme çözünürlük sunanenomic enfeksiyonları). İlk olarak, deneyler, ileri ve farklı konsantrasyonlarda mevcut olan ters primerleri ilave olarak SNP bölge üzerinde merkezlenmiş, kısa problar içermektedir. Bunlar engellenen sondalar nedeniyle prob-şablon ürününün üretimini artırmak asimetrik primer konsantrasyonları PCR sırasında güçlendirilmiş, ancak fazla üretilen ipliğine bağlamak değildir. Aşırı şablon iplikçiği bağlanan prob oluşan bu ayrı bir çift sicimli amplikonlar ~ 20-30 bp; onların anlamlı 10 uyuşmuyor tek veya birden fazla baz prob-şablonla ilişkili çok büyük Tm farklılıklara tüm amplikona (80-150 bp) kurşun oranla uzunluğu azalmıştır. İkincisi, mutant alel amplifikasyon önyargı (MAAB) önyargı polygenomic enfeksiyonlarda düşük oranlarda bulunan mutant alleller doğru reaksiyonu reaksiyon tavlama sıcaklığını düşürür. Tavlama sıcaklığı, mükemmel şekilde uyumlu (vahşi tip), TMS ve uyumsuz (mutan) sonda arasında yer almaktadırs. Bu sıcaklıkta, doğal tipte alel bağlanmasının bu amplifikasyon böylece her iki tek bir örnek 10 içinde mevcut olan mutant aleli doğru amplifikasyon eğimlendirme olarak, uyumsuzluk eşdeğerine göre engellendiği kadar stabildir. Bu İK arıtmalar ile bu teknoloji, bu en az 1 epidemik Güney Amerika&#39;da 11 enfeksiyon ve yeni mutasyonun saptanması, sırayla birbirine hemen yanında yer alan çok sayıda SNP farklılaşma ve mutasyonlarla bağlantılı parazit kökenli izleme ve kimlik sağladı polygenomic örneklerinde 10 allellerin%. Artan hassasiyet ön eleme durumu ve ilaç direncini ortaya çıkan riski olanlara yaklaşan bölgelerde özellikle önemlidir. Hızla ve kolayca bünyesinde azaltılmış hassasiyet ile ilişkili ithal parazitleri ve SNP tespit yeteneği gözetim çabaları ve kontrol programları hakkında bilgiOnların uygulamaları ve artan sıtma eradikasyonu ve eliminasyon çabaları için tanımlar noktaları etkinliği. Bu protokol yöntemleri açıklar bloke prob-bazlı ve MAAB artan HRM genotipleme hassasiyeti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Eradikasyon çabaları yıllardır rağmen, sıtma küresel bir yük olmaya devam etmektedir. Bölgesel eleme ve küresel eradikasyon son yenilenen ilgi sıtma ilaçlara duyarlılığı azalmış ile ilişkili coğrafi nüfus özellikleri yanı sıra varyasyonları da dahil olmak üzere sıtma sorumlu Plasmodium parazit türler hakkında artan genomik bilgiler eşlik etti. Bir ortak genetik varyasyon, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP), parazit genotipleme için cazip hedefler sunuyor. Bu belirteçler ilaç direnci belirteçlerinin izlemek için değil, aynı zamanda ilaç veya diğer seçilmiş basınç altında işaretlerini kullanarak parazit popülasyonlarını izlemek için sadece yararlıdır. SNP genotipleme yöntemleri, ilaç direncini izlemek yanı sıra özellikle Eliminat yaklaşıyor bölgelerde sıtma kontrol çabalarına yanıt olarak, nüfus gözetim için bireysel parazitleri parmak olanağı sunmakiyon durumu. Bilgilendirici SNP belirli genotipleme teknolojilere agnostik olduğunu tespit edilmiştir ederken, yüksek çözünürlüklü erime (HRM) analizi saha bazlı çalışmalar uygundur. Tek etiketli prob bireysel SNP gerektiren ve birden fazla genomları (polygenomic) ihtiva örneklerde SNP tespit etmek, en iyi% 10 hassasiyeti sunan standart floresan prob dayalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, HRM% 2-5 hassasiyeti sunuyor. Böyle bloke prob ve asimetrik primer konsantrasyonları yanı sıra küçük alel amplifikasyonu doğru eğilim PCR amplifikasyon tavlama sıcaklıkları optimizasyonu olarak HRM Değişiklikler, ayrıca İKY&#39;nin duyarlılığını artırmak. Hassasiyet düzelme, spesifik tahlil bağlıdır birlikte, küçük bir alelin en az% 1 algılama hassasiyeti artmaktadır. Sıtma eradikasyonu yaklaşan bölgelerde ortaya çıkan veya ithal ilaç direnci erken teşhis pr için gereklidirOmpT yanıt. Benzer şekilde, polygenomic enfeksiyonları algılamak ve şifreli yerel rezervuar ithal parazit türlerini ayırt yeteneği kontrol programları bilgilendirebilir. Bu yazıda ayrıca, hasta örneklerinde polygenomic enfeksiyonları tespit hassasiyetini artırmak yüksek çözünürlüklü eritme teknolojisi değişiklikleri açıklar.

Veri analizi yazılımları ve enstrüman bağlı çeşitli şekillerde görülebilir. Tipik haliyle, sıcaklık sonuçlarına karşı sıcaklık (-df / dT) göre normalize floresan negatif türevinin bir grafiğidir erime zirvesine görselleştirilmesi ve genotiplerinin tespiti için çok basittir. Tam bir ergime penceresi (40 ° C-80 ° C). Her iki amplikon ve prob eritme bölgelerinde neden 1 her iki bölge için normalize erime zirveleri bir örneğini göstermektedir olacaktır. Belirli SNP tekabül zirveleri net ayrımında sadece sonda bölge sonuçlarına analiz penceresi ayarlanması (Şekil 2). Probe tabanlı analiz açıkça homozigot SNP zirveleri (Şekil 3) maç erime sıcaklıklarında bireysel zirveleri hem allellerin varlığını gösterir. Şekil 4, bu progressi göstermektedirf karışık allel (Şekil 4B) oluşan bir popülasyonda mutant alel için artmış duyarlılık ile sonuçlanan, mutant aleli (sol taraftaki tepe) (Şekil 4A) doğru bir önyargı amplifikasyon (MAAB) sonuç sırasında tavlama sıcaklığı azaltır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Analiz edilebilir, her iki prob (daha düşük bir sıcaklığa) geniş bir erime penceresinde sonuçları sıcaklığın göre normalleştirilmiş floresan negatif türevinin çizimi Şekil 1. Prob ve amplikon eritme bölgeleri. Ve amplikon erime zirveleri. (. Daniels ve diğerleri DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> SNP uyumsuzlukları (gri) düşük erime sıcaklıklarına varken Şekil 2. Probe erime zirveleri. Mükemmel maçlar (genellikle vahşi tip alleller), yüksek erime zirveleri (kırmızı) neden olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Her iki allel bir numunede mevcut olduğunda doruklarına erime Şekil 3. Polygenomic., Prob bazlı HRM analizi, tek alel örnekleri (kırmızı ve gri) maç zirveleri ile iki tepe eğrileri (turuncu) olarak her iki allel temsil eder. (. Daniels ve diğerleri DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">büyük v görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın ersion. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Şekil 4. Mutant alel amplifikasyon önyargı (MAAB). A. Kademeli zirve polygenomic ya polyallelic örnek mutant (düşük sıcaklık) alel karşılık gelen doğru erime zirvesi reaksiyonu amplifikasyon tavlama sıcaklığı yanlılıkları düşürülmesi. B. MAAB polygenomic ya polyallelic numunelerde% 1&#39;den daha az mevcut minör allelleri tespit etmek için İK duyarlılık ile sonuçlanır. (. Bölüm B Daniels ve ark DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Prob tabanlı yüksek çözünürlüklü erime amplifikasyon reaksiyonları Tablo 1. Set-up. <table><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Re başına hacimişlem (96 oyuklu plaka ve kılcal tüp) </td><td> Reaksiyon başına hacmi (384 oyuklu plaka) </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 ul </td><td> 2-2.5 ul </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x Aşırı astar </td><td> 1 ul </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.50 uM </td></tr><tr><td> 10 x Diğer astar </td><td> 1 ul </td><td> 0.5ul </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 ul </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.40 uM </td></tr><tr><td> PCR sınıf su </td><td> 1-2 ul </td><td> 0.5-1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Şablon DNA, </td><td> 1 ul </td><td> 0.5 ul </td><td> 0.01-10 ng / | il </td></tr><tr><td></td><td> 10 ul </td><td> 5 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Standard yüksek çözünürlüklü erime amplifikasyon koşulları. <table><tbody><tr><td> Isı </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> Ambar </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sn </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 devir </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sn </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sn </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 döngü </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sn </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sn </td></tr></tbody></table> * Bu sıcaklık amplikon bağımlıdır Tablo mutant alel büyütme önyargı 3. Çoğaltma koşulları. <table><tbody><tr><td> Isı </td><td> Zaman </td><td> Bisikletler </td><td> Rampa hızı </td><td> Toplama modu </td><td> Analiz modu </td></tr><tr><td> Denatüre </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sn </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Hiçbiri </td&gt; <td> Hiçbiri </td></tr><tr><td rowspan="2"> Döngü </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sn </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Hiçbiri </td><td rowspan="2"> Niceleme </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sn </td><td> 20 </td><td> Tek </td></tr><tr><td rowspan="3"> Eriyik </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sn </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sn </td><td rowspan="2"> Sürekli </td><td rowspan="2"> Eriyik </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sn </td></tr></tbody></table> * Bu sıcaklık amplikon bağlıdır ve MAAB gerçekleştirirken azalacaktır

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

methods-to-increase-sensitivity-high-resolution-melting-single

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Görüntüleme.  Harvard University.  Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır. 

Video: Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu<em&gt; Helikobakter pilori</emDemir Kullanılabilirlik Değişen Koşullarda Üretilen&gt; Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.