オリジナルのGFP - PEM1は博士レイリーから寄贈されたもの。この作品は、NIHとエリソン医学財団からVGへの補助金によってと同様にサポートされて

このプロトコルでは、DSBのが一過性発現珍しい切断エンドヌクレアーゼI - SCEI 3によって生体内で誘導される1,2を構築する染色体に統合されたレポーターにDNA DSB修復の分析のための方法を説明します。統合された分析は、染色体のコンテキスト内でDSBの修復を分析することの利点を提供します。しかし、このプロトコルは、初代培養細胞を扱うとき問題が発生することが継長時間細胞を、必要になります。 別のアプローチは、レポーター構築物はI - SCEIまたはをHindIIIエンドヌクレアーゼでin vitroで消化し ​​、直鎖DNAとして細胞にトランスフェクトされている体外アッセイである。 exctrachromosomalアッセイプロトコール4次の修正で以下に説明する統合されたアッセイに似ています。体外アッセイ用レポーターコンストラクトの統合を省略し、代わりにI - SCEIまたはHindIIIとトランスフェクションのコントロールとしてpDsRed2 - N10.1μgのin vitro で直線化プラスミドNHEJのレポーター0.5μgの細胞を同時トランスフェクション。 HRアッセイ用プラスミドの共トランスフェ2μgのHRの記者は、I - SCEIまたはHindIIIと0.1μgのpDsRed2 - N1で直鎖状。三日間トランスフェクション後にFACSで細胞を分析する。体外アッセイは、継代し、複数の細胞株の解析を容易にする豊富なセルを回避し、一次分離株におけるDSB修復の解析が可能になります。 1。 NHEJとHRのレポーターコンストラクト NHEJのレポーターカセット5 PEM1遺伝子（GFP - PEM1）から工学3キロバイトイントロンを持つGFPの遺伝子が含まれています。 PEM1イントロンは、DSBが誘導のためのHindIII及びI - SCEIエンドヌクレアーゼ（図1a）のための認識配列に挟まれたアデノウイルスのエクソンが含まれています。 I - SCEIのサイトでは、逆方向になります。 I - SCEIはnonpalindromic認識配列を有し、したがって2つの逆方向のサイトには互換性のDNA末端（図1c）を生成します。互換性のDNAは、最高の自然に発生するDSBのを模倣終了します。無傷NHEJカセットはGFPアデノウイルスエクソンGFP ORFを破壊するように負である。 I - SCEIによるDSBが誘導されると、アデノウイルスエクソンは削除され、NHEJは、GFPの遺伝子（図2）の機能が復元されている。このNHEJレポーターのユニークな特徴は、イントロンが欠失および挿入を許容することができるので、それはNHEJイベントの広いスペクトルを検出できることです。 HRレポーターカセット1（図1b）もGFP - PEM1に基づいています。 HRのカセットでは、GFP - PEM1の第一エクソンは、3つの制限部位、I-SceI/HindIII/I-SceIの挿入と組み合わせて22 bpの欠失を含んでいます。欠失は、GFPがNHEJのイベントで再構成することが不可能になります。つのI - SCEIのサイトでは、I - SCEIの消化は、互換性のない両端（図1c）を残すように、逆方向になります。 GFP - PEM1の最初のコピーは、GFP - PEM1のpromoter-less/ATG-less第一エクソンとイントロンが続いている。無傷の構造はGFP陰性である。 I - SCEIの消化によるDSBの誘導時に機能的なGFPの遺伝子は、最初にGFP - PEM1エクソンの二つ変異のコピーの間に分子内や分子間遺伝子変換によって再構成される。 GFP遺伝子の番目のコピーは、最初のATGコドンと第2エキソンを欠くクロスオーバーまたは一本鎖アニーリングされているためとGFPの活動を復元しません。この設計は、哺乳動物細胞で優勢なHRの経路（図3）である遺伝子変換の排他的な検出、することができます。 2。レポーターの統合は、ゲノムに構築<ol><li> NHEJまたはHRのレポータープラスミドの高品質な準備を行う。最良の結果を得るにはキアゲン遠藤フリーキットを使用してください。 280分の260 nmでの吸光度がプラスミドの濃度と純度を測定します。 </li><li> 50μlのNheIを50 U（反応の合計量）37で6時間で消化することにより、レポータープラスミド10μgを線形℃のインキュベーター（蒸発を防ぐために、乾燥したブロックを使用しないでください）​​。キアゲンQiaexIIキット、10mMトリス- HCl pH8.0を20μlのに溶出したDNAを用いた消化液からDNAを精製する。 280分の260 nmの吸光度でDNA濃度と純度を測定します。通常は、精製の間にDNAの20〜30％を失うことになる。未消化のレポーターコンストラクトと一緒に、ゲルに小さな分量（2μl）を実行して、収量と消化を確認してください。精製された線形化レポーター構築物を20℃で保存することができます</li><li>トランスフェクションのための準備で、最高の生育状態に細胞​​をもたらす。凍結バイアルから開始する場合、トランスフェクションの前に細胞を2回に分割。コンフルエント細胞のプレートから始まる場合、それらを一度に分割。 </li><li> 70〜80％コンフルエント（通常正常ヒト線維芽細胞のための二日間、メッキ5 × 10 5 cells/100 mmのプレートなら、）に細胞を成長させる。それは、対数増殖に細胞を持って最高のトランスフェクション効率のための非常に重要です。活発に成長している文化は、Mステージの細胞を（表面に付着した丸みを帯びた細胞として見られる）が含まれています。 </li><li> TRANSFAmaxa Nucleofector以下のメーカーの推奨を用いて細胞をECT。線維芽細胞は、NHDFのソリューションとプログラムのU20を使用してください。トランスフェクションのために、2つの100 mmプレート（〜2 × 10 6個の細胞）から細胞を採取する。それは上の細胞をトリプシン処理することではないが重要です。とすぐにプレートから切り離された細胞の80％として、トリプシン処理を停止します。 NHDF溶液中で細胞を再懸濁します。細胞がNHDFのソリューションに敏感である、従って、インキュベーション時間を最小限に抑え、穏やかに細胞を混在させること。線形化されたレポーター構築0.5μgので細胞をトランスフェクション。レポーターの単一コピーの統合における正常ヒト線維芽細胞の結果で使用されるこれらのトランスフェクション条件は、integrantsの大半を構築する。 </li><li>トランスフェクション後に1 mg / mLのジェネティシン（G418）24を追加することによって、染色体に統合されたレポーターコンストラクトを持つセルを選択します。 7〜10日の選択を続行します。 </li><li> G418耐性コロニーを（あなたが個々のコロニーやプール耐性クローンを選択できます）選択。約5 100 mmのプレートに文化を展開します。将来の使用のための3つのプレートを凍結し、所望の細胞数（通常10百ミリメートルプレートに5つのトランスフェクションのために十分である）に、残りの二つのプレートを展開します。 </li><li>細胞は70〜80％コンフルエント（2日間線維芽細胞を100 mmプレート当り5 × 10 5細胞を播種した後に）到達すると、細胞はI - SCEIが発現するプラスミドでトランスフェクトする準備が整いました。 </li></ol> 3。 I - SCEIエンドヌクレアーゼの一過性発現によるDSBの誘導<ol><li>トランスフェクション〜5μgのI - SCEI発現プラスミドおよび0.1μgのAmaxa Nucleofectorを（NHDFのソリューションおよび線維芽細胞のためのU20プログラムを使用して使用してトランスフェクション効率の制御などのpDsRed2 - N1（Clontech社製）の混合物と対数的に成長する文化の2 × 10 6個の細胞（二つのプレート） ）。 </li><li>同時に、（i）の5μgのプラスミドEGFP発現で〜2 × 10 6個の細胞をtrasfectingによってFACSための3つのキャリブレーションコントロールを用意すること、（ii）5μgのpDsRed2 - N1、表現していないコントロールプラスミドの（ⅲ）5μgを蛍光タンパク質（我々がコードするプラスミドHPRTミニ遺伝子を使用している）。 </li><li> GFPとDsRedタンパク質の発現に十分な時間を提供するために、四日間のために細胞を成長させる。 </li><li> GFPとDsRedの検出のためのフィルターと蛍光倒立顕微鏡でGFPとDsRedタンパク質のトランスフェクションと発現の効率をトランスフェクションを確認した後（省略）三日。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーによるGFP +およびDsRed +細胞の解析<ol><li>トランスフェクションの収穫I - SCEIトランスフェクトした細胞とコントロール細胞の後の四日間。 PBS500μlに細胞を再懸濁し、FACSチューブに細胞を移す。この段階ではすべての細胞を回収し、丸い形の細胞を持つことが重要です。これを達成するために、それは長いトリプシン処理の時間またはより強力なトリプシンを使用することをお勧めします。細胞の99％がプレートから切り離されていることを確認し、顕微鏡下で細胞を観察することによって丸い形を持っている。 （箔と氷のバケツをカバーする）、光から保護氷上で細胞を維持する。数時間のために氷上で細胞を保存することが可能です。のために最良の結果は、収穫直後の細胞を分析する。 </li><li> GFP、DsRedを、およびネガティブコントロールとFACSをキャリブレーション。分析のすべての蛍光細胞（図4）を含めるために、電圧と色補正を調整します。実験試料の蛍光強度は、対照のそれよりも低くなることに留意してください。 </li><li>分析I - SCEI FACSにより細胞をトランスフェクション。私たちは、それぞれの治療のために少なくとも20,000のセルをカウント。 GFPとDsRedの蛍光​​との間の潜在的な干渉を防止するためには、GFPのパーセント+またはDsRed + 25％以下の細胞を維持することが推奨されます。 DsRedを+またはGFP +細胞の割合が高い場合pDsRed2 - N1またはI - SCEIプラスミドの量を減らす。我々の実験では、唯一のpDsRed2 - N1プラスミドのではなく、プラスミドI - SCEIの量を調整する必要がありました。 </li><li> GFP +細胞のパーセントは、DNA DSB修復の効率に相当するとDsRed +細胞のパーセントは、トランスフェクションの効率を示します。 DsRedタンパク質+細胞へのGFP +細胞の比率としてDNA DSB修復の相対的な効率を算出する。 </li><li>修理終了の接合は、修復の精度をテストするために配列決定することができる。レポーターコンストラクトは、複製の大腸菌の起源とカナマイシン耐性遺伝子（図1）を含んでいます。これは、EcoRI酵素、再環状化、および有能な大腸菌細胞への転換でゲノムDNAを消化することによって構造を救出することができます。救出プラスミドを制限酵素消化および配列決定により分析されています。 </li></ol> 5。代表的な結果コントロールのトランスフェクションのとNHEJとHRの実験の代表的なFACSの結果を図4と図5に示す。蛍光強度と蛍光細胞の数は、を積分を含むI - SCEIトランスフェクション細胞で低くなります。ED NHEJとHRの構造（図5）GFPとこれらの細胞にDsRedの構造のコピー数の違いによるコントロール（図4）と比較。実験の各セルは、統合されたレポーター構築のコピーを1つだけ含まれている、したがって、修復が成功のイベントには、細胞の割合で再構築GFP遺伝子を務める。ヒト線維芽細胞では0.1μgpDsRed2 - N1のトランスフェクションは細胞あたり約1プラスミドのコピーを提供します。 NHEJとHRの効率は、GFP + / DsRedタンパク質+細胞の比率として計算されます。 NHEJは、2つのヒト細胞におけるHRよりも効率的なプロセスです。ヒト線維芽細胞ではNHEJの効率は一般的に0.6から1.3であり、そしてHRの効率は0.05から0.3です。 DSB効率は比のGFP + / DsRedを+ I - SCEIとDsRed2の- N1の混合物中の細胞の変化として測定されるためのプラスミドは、結果に影響を与える可能性があります。プラスミドの品質はまた、トランスフェクション効率を変更することにより、結果に影響を与える可能性があります。したがって、一貫性のある測定値を得るために、それは一つの実験内の同じプラスミドミックスを使用することが重要です。また、DSBの修復効率は、細胞型、細胞周期の段階、および統合された構造の染色体位置の影響を受けます。 <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。レポーターはNHEJ（）とHR（B）によるDNA DSB修復の分析のために構築する。 （C）互換性のないDNAは、2つの逆方向のI - SCEIのサイトでの消化によって生成された終了 SD、スプライスドナー、SA、アクセプタースプライス、日陰の正方形、ポリアデニル化部位、ネオ/仮名、単一のORF 2つのプロモーターによって制御される：。哺乳類におけるSV40付与するネオマイシン耐性細胞、及び大腸菌のβ-ラクタマーゼ付与kanamicyn抵抗、オリ、E.大腸菌のpUC複製起点。 <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 。レポーターNHEJの分析のために構築しこの中でGFP遺伝子を構築は非アクティブですがDSBと成功NHEJの誘導時に構造物はGFPの+になります。次に示すのは、NHEJによってこのレポーターの修理の製品です。 <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。レポーターは、遺伝子変換によるHRの分析のために構築する。遺伝子変換（GC）によってI - SCEI、HRによってDSBが誘導されると、アクティブなGFPの遺伝子を再構成。 GC、交差（クロスオーバー）、一本鎖（SSA）アニーリング、およびNHEJ：以下に示す主要なDNA修復経路により、このレポーターの修復の製品です。 X -オーバー修理製品は分子内組換えのために示されている、exramolecular組換えは、同じ製品を与えるが、1つの染色体上に位置される。アクティブなGFPタンパク質を発現する遺伝子（GFP +）緑の色で示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 FACS解析のためのパラメータのキャリブレーション。自動蛍光細胞を除くためのネガティブコントロールとして使用されるプラスミドpHPRT、でトランスフェクション（）線維芽細胞。 （B）繊維芽細胞は、GFP +細胞（緑色の領域）のためのゲートを設定するために使用される、プラスミドpEGFPをトランスフェクト。 （C）線維芽細胞はDsRedタンパク質+細胞（赤色の領域）のためのゲートを設定するために使用されるプラスミドpDsRed2 - N1でトランスフェクト。 <img src="/files/ftp_upload/2002/2002fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。染色体に統合されたレポーターコンストラクトと正常ヒト線維芽細胞におけるNHEJ（）とHR（B）の分析の典型的な結果。

<ol><li>Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+is+required+for+repair+of+nontelomeric+DNA+double-strand+breaks+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).</li>
<li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells.</a> DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+site-specific+endonuclease+stimulates+homologous+recombination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+by+homologous+recombination%2C+but+not+by+nonhomologous+end+joining%2C+is+elevated+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells.</a> Neoplasia. 11, 683-691 (2009).</li>
<li>Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+joining+becomes+less+efficient+and+more+error-prone+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).</li>
<li>Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+by+nonhomologous+end+joining+and+homologous+recombination+during+cell+cycle+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.</a> Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

蛍光NHEJとHRのレポーターアッセイでは、別々にin vivoで各DSBの修復経路を測定するための定量的な方法を提供します。 FACSは、確実に20,000細胞で10 GFP +細胞を検出することができるようなアッセイは、非常に敏感です。アッセイは、DSBの2の誘導後数分または数時間以内GFP +細胞の出現を検出することにより、&quot;リ ​​アルタイム&quot;で修復イベントを測定するために適合させ?...

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Qiaex II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza Inc.</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Invitrogen</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632406</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td>FACS tubes</td></tr></tbody></table>

analysis of dna double-strand break (dsb) repair in mammalian cells

DNA二本鎖切断は、遺伝情報と細胞死の巨大な損失につながる可能性が最も危険なDNAの損傷です。非相同端接合（NHEJ）と相同組換え（HR）：2つの主要な経路を用いて細胞の修復DSBが。 NHEJとHRの摂動は、しばしば早期老化と腫瘍形成に関連付けられている、それゆえに各DSBの修復経路を測定する定量的な方法を持つことが重要です。当研究室では、NHEJとHRの高感度かつ定量的な測定を可能にする蛍光レポーターコンストラクトを開発しました。構文は、DSBが誘導のための珍しいカットI - SCEIのエンドヌクレアーゼの認識部位を含む工学GFPの遺伝子に基づいています。 GFP遺伝子は、追加のエクソンによって、または変異により不活性化されるように始まる構造はGFP陰性である。 NHEJまたはHRによるI - SCEI誘起ブレイクの成功修復は、機能的なGFPの遺伝子を復元します。フローサイトメトリーによってカウントGFP陽性細胞の数は、NHEJまたはHR効率の定量的な尺度を提供する。

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Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

この記事では、GFPベースの蛍光を示して<em&gt; in vivoで</em&gt;別々に相同組換えを定量化し、非相同哺乳類細胞に結合する終了アッセイ。

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

31.7K ビュー.  University of Rochester. この記事では、GFPベースの蛍光を示して in vivoで別々に相同組換えを定量化し、非相同哺乳類細胞に結合する終了アッセイ。

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

遺伝学

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

生物学

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In part, this reflects the availability of methods for the identification of break sites, and characterization of factors recruited to DSBs at those sequences. However, DSBs also appear as intermediates during the processing of DNA adducts formed by compounds that do not directly cause breaks, and do not react at specific sequence sites. Consequently, for most of these agents, technologies that permit the analysis of binding interactions with response factors and repair proteins are unknown. For example, DNA interstrand crosslinks (ICLs) can provoke breaks following replication fork encounters. Although formed by drugs widely used as cancer chemotherapeutics, there has been no methodology for monitoring their interactions with replication proteins.
Here, we describe our strategy for following the cellular response to fork collisions with these challenging adducts. We linked a steroid antigen to psoralen, which forms photoactivation dependent ICLs in nuclei of living cells. The ICLs were visualized by immunofluorescence against the antigen tag. The tag can also be a partner in the Proximity Ligation Assay (PLA) which reports the close association of two antigens. The PLA was exploited to distinguish proteins that were closely associated with the tagged ICLs from those that were not. It was possible to define replisome proteins that were retained after encounters with ICLs and identify others that were lost. This approach is applicable to any structure or DNA adduct that can be detected immunologically.

While replication fork collisions with DNA adducts can induce double strand breaks, less is known about the interaction between replisomes and blocking lesions. We have employed the proximity ligation assay to visualize these encounters and to characterize the consequences for replisome composition.

抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

RPA2免疫蛍光染色によるG1期一本鎖DNA病巣の検出

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

著者スポットライト:治療上の洞察のためのDNA修復中の一本鎖DNAの可視化 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

要約

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マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

要約

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マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション