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パートA：細菌培養物のハイスループット成長。 1。 24ウェルプレートを用いた自己誘導培地2mlで一晩細菌を培養<ol><li>マイクロ波で24ウェルプレートを滅菌する。 </li><li>新たに増殖させた細菌コロニーまたは冷凍グリセロールストックと自己誘導培地（オーバーナイトエクスプレス媒体）の1.5ミリリットルを接種する。我々は通常、3つの個々のクローン化されたコロニーで変異につき3ウェルに接種。陽性および陰性対照引当金6ウェル。我々は3つの野生型クローンが育つポジティブコントロールのため、我々は非発現プラスミドで形質転換された2つのクローンを育てるネガティブコントロール用。培地のみの対照のためのよく空白の1を残すことによって、プレートの十分な殺菌を確認してください。 </li><li> ℃、250 rpmで振盪しながら37℃で18時間細胞を成長させる。我々は、lac誘導BL21（DE3）のロゼッタ2細胞を使用しています。自己誘導培地は、グルコースとラクトースの混合物を含んでいます。当初は細菌ブドウ糖を餌にしてから、また、組換えタンパク質の発現を誘導する乳糖を使用し始める。 </li><li>蓋を外し、ロボットプラットフォームの上にプレートを置きます。 </li></ol>パートB：組換えタンパク質の精製ロボット。 2。ロボットプラットフォームを準備<ol><li> 20 mMイミダゾール、0.1％トリトンX-100、0.5M NaCl、20mMのTris-酢酸、pHは7.9、10mMのMgOAc 2、0.7 mMのZnOAc 2、10％グリセロール、および構成された溶出緩衝液からなる洗浄緩衝液を作る0.5Mのイミダゾール、0.1％トリトンX-100、0.5M NaCl、20mMのTris-酢酸、pHは7.9、10mMのMgOAc 2、0.7 mMのZnOAc 2、10％グリセロール。これらのバッファは、タグ付けされたタンパク質は、それらに結合された後、ビーズを洗浄したり、それぞれ、ビーズからタンパク質を溶出するために使用されます。 </li><li>細菌の希釈液（15μlの消泡剤と100mlの蒸留水）を作る。この溶液は、使用されます光学密度（A600）測定のための細菌の一晩培養物の希釈液を作る。希釈剤中に消泡剤の存在は、プレートリーダーの測定を妨害する気泡の形成を防止する。 </li><li> 10xのファーストブレイク試薬、サンプルあたり2μlのlysonaseおよび15mM MgOAc 2からなる溶解液を作ります。ファーストブレイクは、細菌の細胞壁を破壊し、細胞内タンパク質の放出を容易にする洗剤と塩の混合物を含んでいます。 Lysonaseはリゾチームとヌクレアーゼの独自のミックスです。リゾチームは、細胞壁を破壊することを支援し、ヌクレアーゼがリリースされました細菌の核酸を消化。 </li><li>オプション：6 Mグアニジン塩酸塩溶液を構成してください。いくつかの組換えタンパク質は、テフロンコーティングペッティング針に固執する傾向がある。グアニジン塩酸塩溶液が変性タンパク質と日常的にそれぞれのST後に洗えるロボットピペットチップをすすぐために使用される水よりも効果的にそれらをオフに洗うEP。 </li><li>ペプチド結合は+ BCA試薬中に存在CuSO 4のコンポーネントからCu 1にCu 2を軽減+それによって：ミキシングビシンコニン酸溶液（試薬）と硫酸銅溶液（試薬B）によってBCA（ビシンコニン酸）タンパク質定量試薬を調製Cuの1の量+は溶液中に存在するペプチド結合の数に比例します。第二段階では、ビシンコニン酸キレート銅1の2つの分子は+紫の色で、その結果、562 nmの吸光度のシフトが生じる。呈色反応は、時間に依存しており、通常は決定的であるといくつかの時間を必要とします。その後色は数時間安定です。 </li><li>正しいサイズのトラフまたはプレートを記入し、ロボットのプラットフォーム上で、事前に割り当てられた位置に配置します。 </li><li>グアニジン塩酸塩の廃棄のための場所1 24ウェルプレート、OD 600及び吸光度測定のための2つの明確な96ウェルプレートと1番目の青の96ウェルプレート電子プラットフォーム上で自分の位置でタンパク質を精製した。マグネットスタンドの上に置いて1 96ディープウェルプレート。 </li><li>蒸留水で5倍に彼らのHis-タグとキレートおよびビーズ攪拌部にそれらを埋めるを形成することにより、タンパク質を結合MagneHisニッケル粒子を希釈します。懸濁液中にビーズを保つためにスターラーを切り替えます。 </li><li>ロボットプラットフォームの電源を入れて、そうでなければペッティング精度を妨害する気泡を除去するために数分間ピペッティング針をフラッシュします。再利用可能なピペッティング針は個々のピペッティング·ステップの間にフラッシュされます。あるいは、使い捨てチップを使用することができる。全ての後続ステップは、ロボットにより行われている。ロボットのプロトコルは、リクエストに応じて利用可能です。 </li></ol> 3。細胞増殖がOD600を測定することによってチェックされる<ol><li>一晩培養した培養液10μlの希釈液の90μlに希釈される。 </li><li>細菌が同様の密度に成長していることを確認するために、OD 600を測定（ 図1）。 </li></ol> 4。細胞はタンパク質を放出するとビーズの結合を許可するために分割され<ol><li>磁気のNi-ビーズ懸濁液100μlを2番目の24ウェルプレートの各ウェルに分配される。 </li><li>各小規模な細菌培養900μlのビーズを含む24ウェルプレートに移しています。 10xのファーストブレイク/ lysonaseミックスの100μlを添加する。 </li><li> 24ウェルプレートを室温で30分間急速振とう（800 rpm）で振とうプラットフォームに転送されます。細菌の細胞壁は、機械的な力と化学作用の組み合わせによって破壊されており、組換えにより産生されたタンパク質は溶液中に放出されています。それらの親和性タグを使用して、彼らはすぐに常磁性キレートニッケルビーズをバインドします。 </li></ol> 5。ビーズを洗浄し<ol><li>再懸濁した磁性ビーズを含有する細胞溶解物はmで、スタンド上に配置され、96ディープウェルプレートに転送されますagneticロッドウェル間でそのスライド。 96ウェルプレートの上清容易に取り外すことができます正方形円錐形の底部を持っている。井戸は2.1ミリリットルまでのボリュームを保持することができますが、はるかに少量で満たされている。これは飛散して、サンプルのクロスコンタミせず精力的な揺れの手順を実行することを可能にする。 </li><li>ピペットチップを6Mグアニジン-HClで個々のピペット操作の間に洗浄される。このステップでは、交差汚染を回避するためTFIIBと他の &quot;スティッキー&quot;タンパク質の精製のために重要です。他のタンパク質と、それはピペット操作の間に水で広範囲に針をリンスするのに十分かもしれません。 </li><li>マグネットスタンドの磁気ロッドは、常磁性ビーズを引き付ける井戸の中心からそれらを引き離し、ピペッティング針の上清への無料アクセスを許可します。上清は廃棄されます。 </li><li>洗浄緩衝液500μlの最初の24ウェルプレートに添加し、続いてeに96ウェルプレートに移し、ビーズの完全移転をnsure。 24ウェルプレートをシェーカーから削除されます。 </li><li>洗浄緩衝液の別の500μlを96ウェルプレートに直接追加され、プレートをシェーカーに移し、精力的に1分間振とうする。プレートは磁気スタンドに戻って移動し、洗浄緩衝液は廃棄されます。 </li><li>このステップは2回繰り返されており、洗浄手順をプレートから任意のバッファ残骸を除去することによって完了します。 </li></ol> 6。溶出バッファー中でタンパク質を溶出<ol><li>溶出緩衝液100μlをビーズに添加され、プレートをシェーカーに移し、精力的に室温で30分間振とうする。 </li><li>プレートが精製された組換えタンパク質を含む、シェーカー、溶出液に戻され、新しいプレートに移しています。 </li></ol> 7。精製したタンパク質の濃度を測定<ol><li> BCA試薬ミックスの190μlを明確に96ウェルプレートに移し、プロの10μlさTEIN溶液を添加した。 </li><li>インキュベーション（通常は5月6日または一晩）の数時間後、吸光度を測定し、精製されたタンパク質製剤（図2）のそれぞれの濃度を決定するためにBSAの基準と比較します。 </li><li>精製されたタンパク質は、現在適切な濃度（図3）下流のアプリケーションに使用することができます。 </li></ol> 8。代表的な結果精製プロトコルは、2つの品質管理段階に示されており、それらの例を提供しています。我々は、精製されたタンパク質の収率（ 図2）を評価する際に細菌の成長段階（ 図1）およびそれ以降の潜在的な問題を識別して文書化することができます。我々は通常、タンパク質を精製し、三重にしてテストします。これは、2つの品質制御ステップと組み合わせることで、私たちは私たちの機能的アッセイで観察された任意のバリエーションが変異phenotypによるものであることを自信を与える実験的な変動したか失敗した精製によって引き起こされる電子（ 図3）としない。収量は一般的に50から200μgの範囲を取得しており、様々な機能アッセイのために十分以上です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> 図1。一晩培養した培養物を24ウェルプレートのOD測定値のヒストグラム。同様に野生TFIIBのように6 TFIIB突然変異体の3つのクローンが栽培されている。媒体と非発現プラスミドと井戸を運ぶ2つのクローンが唯一ネガティブコントロールとして機能します。 OD測定は、個々の文化の間で成長率のわずかな変動があることを示している。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> 図2。タンパク質収量は、BCAアッセイによって決定されるように、これらの培養物から得られ、SDS PAGEにより確認した。亜種の一つが高レベルで発現されていません。 comの図1とbinationは、我々は、これが差分細胞増殖に起因するが、適切に誘導されていないタンパク質の発現によるものではなかったと結論付けることができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> 図3。転写アッセイの代表的な結果 。我々はRNAPによる小頓挫転写産物の生産にTFIIBの変異体の刺激活性を測定した。ここでは、TFIIB残基K87の単一のアミノ酸置換の完全なライブラリの刺激効果が示されています。再現性の高い度合いが小さいエラー率によって確認された。野生型（WT）、ネガティブコントロール（NC）と溶出バッファーに比べて3変異体の性能を示すサンプルゲルが唯一コントロールが下に描かれている。

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

自動化された組換えタンパク質の精製方法は、ここで説明する最低限の人間の介入と再現性の高い条件下での小規模な形式で変異多数のタンパク質の産生および精製を可能にします。体系的な品質コントロールとの例を図1および図2の結果は、タンパク質を精製した。 図は、この例で使用される精製された転写因子が機能アッセイに再現性の高い方法で実行することを図3に示す。 手順は古TFIIBの精製のために開発されたにもかかわらず、それは親和性タグ融合タンパク質の精製のための広く適用することができる。このような自動化された精製プロトコルの使用は、大幅に組換えタンパク質の生化学的解析を容易にするでしょう、したがって、手動で達成することは困難であるスケールでのタンパク質 - タンパク質相互作用の理解を促進します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>一晩エクスプレスインスタントTB培地</td><td>メルクケミカルズ株式会社</td><td> 71491から4 </td><td></td></tr><tr><td>ファーストブレイク</td><td>プロメガ株式会社</td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonaseのバイオプロセス用試薬/ 1ミリリットル</td><td>メルクケミカルズ株式会社</td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td>消泡剤204 </td><td>シグマアルドリッチカンパニー株式会社</td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHisニッケル粒子</td><td>プロメガ</td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>シグマアルドリッチカンパニー株式会社</td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>シグマアルドリッチコンプ任意株式会社</td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td>ビシンコニン酸タンパク質測定</td><td>シグマアルドリッチカンパニー株式会社</td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td>ディープウェルプレート2.2ミリリットルスクエアウェルズPP PK10 </td><td> Anachem株式会社</td><td> 1810年から1800年</td><td></td></tr><tr><td>マイクロウェル、96ウェル平底ポリスチレンは、5プレートの12袖クリア0.4ミリリットルウェル体積128ミリメートルX 86ミリメートルサーモサイエンティフィックヌンクを扱われていない</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートブルー</td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルブロック、RB（24） </td><td>キアゲン</td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸グアニジン</td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> TheOnyx用洗える針</td><td> Aviso社</td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズ用の試薬ラック</td><td> Aviso社</td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダーSynergyは、HT </td><td> BioTekの</td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td>ロボットプラットフォームTheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso社</td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシェーカーVariomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルマグネットタイプ</td><td>キアゲン</td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

X線結晶構造解析は、タンパク質の構造の詳細なビューを得るための最適な方法である。このような研究は、構造/機能の関係を詳細に洞察力を得るために、さらに生化学的解析によって補完される必要があります。オリゴヌクレオチド及び遺伝子合成技術の進歩により、全19の他のアミノ酸による標的残基の置換​​を含む、大規模な突然変異誘発戦略がますます実現可能にする。ゲインまたは機能喪失型の表現型は、そのような触媒活性、タンパク質の安定性および/または蛋白質 - 蛋白質相互作用の特異性への特定の残基の寄与として、体系的な結論を引き出すことができます。 突然変異の性質に異なる表現型を属性にするために - ではなく変動する実験条件に - それは、制御された再現可能な方法でタンパク質を精製し、分析することが不可欠である。高スループットの戦略やマニュアルのプロトコルの自動化にロボット液体処理プラットフォームは、少し人間の介入と最小限のエラー率1-5から 、このような複雑な分子生物学的な手順を実行する機会を作成しました。 ここでは、ハイスループットな方法でHisタグ組換えタンパク質の精製のための一般的な方法を提示する。最近の研究では、TFIIBの詳細な構造と機能の研究、基礎転写機構のコンポーネントにこの手法を適用した。 TFIIB は 、in vitro でプロモーター特異的転写のために不可欠であり、前開始複合体6から8へのRNAポリメラーゼの募集のために不可欠なものです。 TFIIBはRNAポリメラーゼ9-11の裂け目活性部位を貫通フレキシブルリンカードメインが含まれています。このリンカードメインはTFIIB、すなわち（i）転写開始の &quot;失敗に終わった&quot;段階での触媒活性の刺激に2生化学的に定量化できる活動を与える、および（ii）の追加拠出前開始複合体4,5,12にRNAポリメラーゼの特異的動員。我々はTFIIBリンカー内シングル、ダブル、トリプルの置換や削除突然変異を生成し、その後RNAポリメラーゼ4の触媒活性に及ぼす刺激効果のための機能的アッセイにおいて、それらを分析するために、ハイスループット精製法を利用した。要するに、我々は、精製し、381変異体を解析し、生成された - 時間がかかり、手動で実行することが面倒だっただろう作業を行います。我々は、生産され、私たちはどんな実験的な変形を理解させ、私たちの結果の再現性の明確な考えを与えたmultiplicates中のタンパク質を測定した。 この方法では、Hisタグ融合タンパク質の精製のための一般的なプロトコルとして機能し、首尾よく他の組換えタンパク質を精製するために使用されています。それは現在、24のタンパク質の精製のために最適化されていますが、最大96個のタンパク質に精製するために適合させることができます。

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High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K ビュー.  Imperial College London. 我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...