This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

目的のタンパク質を発現する安定な細胞株の1世代<ol><li>熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することによって、メディアの準備は、市販のダルベッコのグルタマックスI、ピルビン酸、および4.5グラム/ LのD-グルコースを補充したイーグル培地（DMEM）を改変します。 </li><li> 5％CO 2中、37℃で培地中でHEK293細胞を育成。二日おきに細​​胞をサブ養います。メディアを取り出し、そして15mlの新鮮な培地で細胞を懸濁します。新しい75cm 2の細胞培養フラスコにピペット1ミリリットルと14ミリリットルのメディアを追加します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を分析します。 </li><li>ウェルあたり2×10 5細胞の密度で6ウェルプレート中のHEK293細胞をシードし、24時間インキュベートします。 </li><li>トランスフェクションのためにトランスフェクション試薬の製造業者によって提供されるプロトコルを使用しています。トランスフェクション試薬を使用したpEGFP-C2かのpEGFP-C2-CaeBで細胞をトランスフェクトします。使用前に、トランスフェクションREAGを温めますENTとRTに必要なメディア。 DNAにトランスフェクション試薬の1の比率：3を使用してください。 <ol><li>具体的には、ピペットトランスフェクション試薬1.5μlの直接無血清DMEM培地50μlの中へ。複合体形成のために、トランスフェクション試薬を含有する混合物にDNAをコードするGFPまたはGFP-CaeB0.5μgのピペットを、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>滴下様式で、反応混合物を添加することにより細胞をトランスフェクトし、24時間、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li></ol></li><li> 1 mgの追加/ 5％CO 2中37℃でGFP陽性クローンの選択のためのゲネチシンミリリットル。 </li><li> 1比：6日後、1媒体及びHEK293上清を保有する96ウェルプレートでのソート、フローサイトメトリーにより単一細胞を単離します。 4966×gで15分間遠心分離し、培養し、コンフルエントHEK293細胞からのHEK293上清を生成します。 </li><li>次の日に、1.5を含む培地で培地を交換し0; mg / mlのジェネティシン。週に一度メディアを変更します。細胞がコンフルエントな単層を形成する場合は、24ウェルプレートに移します。 1.5 mg / mlのジェネティシンを含む培地中で5：1の割合で週二回の細胞をサブ養います。最後に、免疫ブロット分析によってGFP陽性細胞の割合を分析し、フローサイトメトリー。 </li></ol>イムノブロット分析により安定な細胞株の2分析<ol><li>上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。 </li><li>負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。 </li><li> PVDF膜上にブロットタンパク質（0の細孔サイズ。トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧で45ミクロン）。 </li><li>室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。 </li><li> MPTの4mlに抗GFP抗体の4μLを希釈し、4℃で膜をO / Nインキュベート。 </li><li> 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。 </li><li> MPTの4ミリリットル中に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を0.8μlの膜をインキュベートします。 </li><li> RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（2.6参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 </li></ol> 3.フローサイトメーターを用いて細胞を分析します。 <ol><li> PBSで細胞を再懸濁します。フォワード皮下調整する陰性対照としてHEK293細胞を使用してatter（FSC）および側方散乱（SSC）は、細胞スケールであることになります。細胞ダブレット、凝集体および細胞破片を除くことにより、生細胞にゲートを描きます。 </li><li>未染色細胞がはるかにFL1チャネル（488 nmのアルゴンレーザー）のヒストグラムの左側にあるように、光電子増倍管（PMT）のゲインを調整します。 </li><li> HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞の蛍光強度を分析するためにFL1チャネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団に10,000事象を獲得します。 </li><li>商業FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析します。 </li></ol>誘導性の発現ベクター系で安定細胞株の4トランスフェクション<ol><li>シードHEK293細胞を安定/ウェルの1×10 5細胞の密度で12ウェルプレート中でGFPまたはGFP-CaeBを発現します。 </li><li> 19時間後播種、レギュレータプラスミドと応答プラスミドエンコードのBaxまたは活性化カスパーゼ3のいずれかで細胞を同時トランスフェクト。 <ol><li>安定したHEK293細胞を共トランスフェクトpWHE125-Pレギュレータプラスミド（ 図2）と応答プラスミドpWHE655-hBaxまたはpWHE655-revCasp3（ 図3）とポリエチレンイミンの0.4μlと100 ngの100 ngのと。 </li><li>のOpti-MEM培地の75μlのDNAおよびポリエチレンイミントランスフェクション試薬をそれぞれ調製し、室温で正確に5分間インキュベートします。複合体形成のために、室温で15分間、両方の混合物を一緒にインキュベートします。 </li></ol></li><li>ポリエチレンイミン/ DNA溶液を滴下細胞を追加し、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li></ol>アポトーシスの誘導5。 <ol><li>トランスフェクション後5時間では、培養培地への1 / mlのドキシサイクリンを添加することによって、プロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。 5％CO 2中、37℃で18時間、細胞をインキュベートします。 </li></ol>イムノブロット分析によって宿主細胞のアポトーシスの6分析<ol><li>時間の前に細胞を検査細胞死誘導を確認するために、光学顕微鏡下でarvesting。アポトーシス細胞は死にかけのセルを囲むアポトーシス体の存在によって検出可能です。 </li><li>上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。 </li><li>負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。 </li><li>トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧でPVDF膜上にブロットタンパク質（孔径0.45μmの）。 </li><li>室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。 </li><li> 4μを希釈MPTの4ミリリットル中の抗切断ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）抗体のLと4℃でO / Nインキュベート。 </li><li> 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。 </li><li> 4ミリリットルMPTで希釈した0.8μ​​lの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を有する膜をインキュベートします。 </li><li> RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（6.7参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 </li><li> 7ミリリットルウエスタンブロットストリッピング緩衝液で室温で30分間のインキュベーションによって結合した抗体を除去します。 </li><li> PBS / 0.05％のTween 20（6.7を参照）で3回洗浄した後、4℃でMPT O / N 4ml中の抗アクチン抗体4μlので膜をプローブ。 </li><li> MPT（6.7で説明したように）で3回の洗浄工程の後、ホの0.8μlの膜をインキュベートrseradishペルオキシダーゼ結合二次抗体は、MPTの4ミリリットルに希釈しました。 </li><li>室温で1時間インキュベートした後、0.05％/ PBSで膜を6.7に記載されているようにトゥイーン20を（3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 注：全てのインキュベーションステップは示された時間および温度で、プレートシェーカー上で実施しました。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

多くの病原性細菌は、宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の分泌または転位する分泌系を保有します。これらのエフェクタータンパク質は、細菌が生存し、それらのそれぞれの細胞内ニッチ内で複製することができ、宿主細胞内でプロセスおよび経路を調節する能力を有します。生化学的活性およびエフェクタータンパク質の分子機構を理解することは、病原性のより良い理解に向?...

多くのグラム陰性細菌病原体の毒性は、真核生物宿主細胞をハイジャックするための特殊な分泌系に依存します。細菌は細胞および生化学のさまざまな活動を調節するために宿主細胞への細菌の病原性タンパク質（エフェクター）を注入するために、これらの分泌系を使用しています。エフェクタータンパク質の研究では、ホスト/病原体相互作用の基本的な側面にも真核細胞1の基本的な生物学に顕著な洞察を提供しているだけではなく。宿主細胞のアポトーシスの調節は、多くの細胞内病原体のための重要な病原性機構であることが示されており、アポトーシスを調節するエフェクタータンパク質の数は2-9同定されています。しかし、活性のそれらの正確な分子機構は、多くの場合、とらえどころのないままです。 アポトーシス、プログラム細胞死の形態は、感染10に対する免疫応答に重要な役割を果たしています。アポトーシスに導く二つの主要な経路は、持っています特定されて：原形質膜（外因性アポトーシス）で細胞死受容体を介したミトコンドリア（内因性アポトーシス）または信号の直接伝達を標的とします。真性またはミトコンドリア媒介性の細胞死経路は、細胞内シグナルによってトリガーされ、BaxおよびBakの、のBcl-2ファミリーの2プロアポトーシスメンバーの活性化が関与しているされています。このファミリーは、細胞死を制御11-14プロおよび抗アポトーシス調節タンパク質で構成されています。アポトーシスの活性化はBaxおよびBakののオリゴマー化につながる細胞質へのシトクロムCの放出をもたらす、ミトコンドリア外膜のその後の透過処理が続きます。シトクロムcの放出は、アポトソーム15におけるカスパーゼ9の活性化を介してエフェクターカスパーゼ3および7の活性化を開始します。これは、とりわけ、細胞表面16上のホスファチジルセリンの暴露をもたらす、選択された基質のタンパク質分解をもたらし、CHをフラグメント専用のDNアーゼを解放します17,18 romatin。 アポトーシスカスケード内の個々のエフェクタータンパク質が干渉を決定するために、誘導可能な発現系は19を使用しました。導入遺伝子の条件式のための規制システムは、細胞内のタンパク質の機能や組織、器官および生物開発のための重要性だけでなく、開始、進行および疾患20-23のメンテナンス時の解析に貴重なツールとなっています。典型的には、このようなここで使用のTetシステム24と誘導制御システムは、（ 図1参照）人工的な転写単位を形成します。一方の成分は、転写活性化または24,26のサイレンシングを媒介する哺乳動物タンパク質ドメインに細菌転写抑制のTetR 25の融合によって形成されたtTA（テトラサイクリン依存性転写活性化因子）と呼ばれる人工的に操作した転写因子を、あります。第二成分は、ハイブリッドでありますプロモーター、真核生物の最小プロモーターからなる、TRE（テトラサイクリン応答性エレメント）と呼ばれる、少なくともTATAボックスおよび転写開始部位を含む、のTetR、 のtetO 24,25用の同族のDNA結合部位の複数の反復に接合。第三成分がのTetR、テトラサイクリンまたはそのようなアンヒドロやドキシサイクリン25その誘導体、の1の天然リガンドです。培地へのリガンドを添加すると、のTetRはのtetOに対するその親和性を失い、TREから解離します。その結果、標的遺伝子の転写が廃止されています。導入遺伝子の発現は、このように、しっかりと両方の細胞培養および動物20,23,24における時間および用量依存的に制御することができます。 tTAをして、導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンの存在を除いて、構成的に発生します。テトラサイクリンは、最初の導入遺伝子の前に、システムから除去されなければならないので、これは細胞毒性または発癌性タンパク質の研究で不利であることができるexpressionが起こると、細胞上の標的タンパク質の効果をモニターすることができます。これは時間がかかり、特にトランスジェニック動物において、常に27完了していないことができます。この制限に対処するために、ドキシサイクリンの存在に逆応答とのTetR変異体は、新しい転写因子を生成するために使用された、rtTAの28（tTAをリバース）。それはTREに結合し、同時に、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化するのみ。残留システムの漏れやすさ、 すなわち 、TRE結合転写因子の非存在下での導入遺伝子の発現は、ゲノム組み込み部位での位置効果から（I）のいずれかを発信し、（ii）のTRE自身29、または（iii）からの非から固有のtTA / rtTAの28の結合、追加の転写サイレンサーを導入することによって対処された、システムに（テトラサイクリン依存性転写サイレンサー）30のtTSと呼ばれます。これは、rtTAの（ 図1参照）と一緒に二重の調節ネットワークを形成します。ドキシサイクリンの非存在下では、TTSはTREに結合し、積極的に残りの転写をシャットダウンします。ドキシサイクリンの存在下では、TTSはTREから解離したrtTAを同時に標的遺伝子の発現を誘導結合します。ストリンジェンシーのこの追加の層は、高活性の細胞毒性タンパク質31〜34を発現することがしばしば必要です。 この厳密に制御デュアルレギュレータ方式を使用して、アポトーシスカスケードは、与えられたエフェクタータンパク質は、アポトーシス誘導を妨害することができるかどうかの分析を可能にする定義された段階で開始することができます。この方法は、細菌のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を研究するために使用されるだけでなく、プロアポトーシスまたは毒性タンパク質の誘導性発現のために、または他のシグナル伝達経路との干渉を解剖するためのすることはできません。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>life technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>life technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&amp;nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-cleaved PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

ここに提示された技術は、いずれかの標的タンパク質、あるいは小分子ステップれる分析することができ、シグナル伝達経路の構成要素と相互作用します。この方法は、選択されたシグナル伝達カスケードで定義され、所定のステップでシグナル伝達事象を開始するために、一方では、特定のタンパク質の誘導性発現に基づいています。一方、目的の遺伝子の同時発現は、その後発現される標的タンパク質の活性が上流または開始シグナル伝達事象の下流で、得られたシグナル伝達経路の読み出しに依存する場合、治験責任医師が評価することができます。ここでは、アポトーシスカスケードは、プロトコル機能性を実証するために定義されたシグナル伝達経路として選択しました。例えば、 コクシエラバーネッティなどの病原性細菌は、細胞内の細菌の生存を確保するために、それらのを促進するために宿主細胞において、宿主細胞死の誘導を妨害するエフェクタータンパク質を転生物における普​​及。 C.バーネッティエフェクタータンパク質CaeBを効果UV光を伴うまたはスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導後に宿主細胞の死を阻害します。 CaeBはアポトーシスシグナルの伝達を妨害するステップで絞り込むには、十分に特徴付けられたプロアポトーシス活性を有する選択されたタンパク質は、ドキシサイクリン誘導性の方法で一時的に発現させました。 CaeBはこれらのタンパク質の上流に作用する場合、アポトーシスが妨害されずに続行されます。 CaeB下流に作用する場合、細胞死が阻害されます。選択した試験タンパク質は、主要な執行プロテアーゼであるミトコンドリアのレベルで作用バックス、およびカスパーゼ3でした。 CaeBはBax発現により誘導される細胞死を妨害ではなく、カスパーゼ3発現による。 CaeBは、したがって、これら2つのタンパク質間のアポトーシスカスケードと相互作用します。

まず、GFP融合タンパク質として安定に関心（CaeB）のタンパク質を発現するHEK293細胞株を樹立しました。対照として、安定的にGFPを発現するHEK293細胞株も作製しました。 GFPおよびGFP-CaeBの発現は、免疫ブロット分析によって確認しました。代表的なイムノブロット（ 図4A）は、GFPおよびGFP-CaeBの安定と明確に検出可能な発現を示しています。しかし、このアッセイは、全ての細胞?...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K ビュー.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

遺伝学

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

免疫・感染学

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

リーシュマニア症治療のためのテトラサイクリン制御合成回路の設計

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a step toward therapeutic intervention targeting host-associated factors that drive leishmaniasis. Synthetic biology entails the engineering of genetic components in an orthogonal and modular manner to precisely modulate biological systems, imparting novel functions to cells. In the presented study, elucidation of a systematic pipeline for the development of an inducible tetracycline-controlled (TetON)-based synthetic circuit was aimed at delivering succinate dehydrogenase as a therapeutic agent to facilitate the elimination of intracellular Leishmania parasites. The outlined protocol describes the designing of a synthetic circuit and its subsequent validation. The proposed strategy also concentrates on the incorporation of synthetic circuits in the plasmid backbone as a delivery vehicle. Additionally, delivery machinery employing polyplexes-based nano-particles for the delivery of synthetic circuits was used in murine macrophage cell lines without compromising the cellular morphology. Standardization of the method was conducted for selecting transfected cells and determining optimal induction concentration for synthetic circuit expression. Observations reveal a distinct reduction in intracellular parasite burden in transfected cells compared to infected cells. Pro-inflammatory cytokines were expressed post-infection in synthetic circuit transfected and induced cells as a mechanism to promote parasite elimination. This underscores the synthetic biology-based method as a potent approach in leishmaniasis by targeting host factors associated with disease progression.

著者スポットライト: リーシュマニア 大感染症における革新的な治療法のためのシステムと合成生物学の活用

Here, a protocol for designing, constructing, and delivering tetracycline-controlled based inducible synthetic circuit is presented. The effect of the synthetic circuits on parasite elimination and cytokine expression can be studied by channelizing the presented pipeline. This protocol is relevant for researchers studying synthetic circuit-based therapeutics in infectious diseases.

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

生物工学

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

要約

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感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

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植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム