システムバイオロジーは、感染モデルの生物学的ネットワークとメカニズムに関する洞察を提供し、合成生物学は精密治療を可能にします。私たちは、リーシュマニア大感染症における免疫代謝と、疾患解決のための生合成回路の可能性を探求しており、免疫療法に革命をもたらしています。近年、合成生物学は、リーシュマニア症と闘うためのより新しく効果的な戦略の開発に向けて大きな期待を示しています。
最近の開発の一部は、人工サイトカイン、双安定合成回路CRISPR-Cas9のエンジニアリングの分野であり、合成ペプチドは治療薬として研究されています。私たちのプロトコルは、寄生虫によってその生存のために調節される宿主タンパク質を標的としています。したがって、寄生虫だけでなく、宿主に対する回路への影響についても研究しています。
さらに、合成回路がホストでの送達時に直交性とモジュール性機能に対処する効果について研究しました。まず、コンピューターでTinkerCellソフトウェアを開き、[パーツ]タブをクリックします。ライブラリからCMVプロモーターコンポーネントを選択し、キャンバスに配置して、合成回路内のサイトメガロウイルスプロモーターを象徴します。
次に、テトラサイクリンオペレーターに類似したリプレッサー結合部位を取得し、キャンバス上のプロモーターに隣接して配置し、CMVプロモーターと統合します。内部のリボソームエントリーサイトとコーディング領域をキャンバスにドラッグアンドドロップし、それらを既存の遺伝的要素と統合します。コーディング領域の名前を tetracycline-responsive repressor に変更します。
これらの遺伝的要素をマージして、合成部品の構築を容易にします。ブタテスコウイルス12Aによって切断可能なスペーサー領域をキャンバスに組み込みます。合成コンストラクトに目的の遺伝子を表し、他の要素と統合する追加のコード領域、コハク酸デヒドロゲナーゼまたはSDHAを導入します。
SDHAコード領域に隣接して、細胞性プロテアーゼブタテスコウイルス12Aによって切断可能な別のスペーサー領域を統合する。レポーター遺伝子を表すコード領域を導入し、それをコンストラクトにGFPとして標識します。GFP の隣にターミネータを追加します。
機能的な遺伝的回路の形成を確認するには、回路の任意の部分をクリックします。クリックすると、回路が赤く表示されます。「反応」タブで、テトラサイクリン応答性リプレッサー、SDHA、およびGFPに調節速度を割り当てて、合成回路内の翻訳反応を描き出します。
[パーツ]タブから小分子を追加し、doxycyclineという名前を付けます。ドキシサイクリンに波動関数を割り当てるには、parts and connectionタブからinputを選択し、wave inputをクリックします。「リアクション」タブから、「repression reaction」をクリックします。
反応速度をキャンバス上でdoxとテトラサイクリン応答性リプレッサーの間にドラッグアンドドロップします。doxとテトラサイクリンレスポンシブリプレッサー間の反応速度を設定するには、doxの波動関数アイコンをダブルクリックし、doxycycline.sinを調整します。振幅を 10 に設定します。
テトラサイクリン応答性リプレッサータンパク質とリプレッサー結合部位との間の転写調節反応を実施するには、反応タブから反応を選択し、テトラサイクリン応答性リプレッサーとテトラサイクリンオペレーターの間のキャンバス上に配置します。各成分と反応をダブルクリックし、シミュレーションの初期濃度とパラメータを設定します。[シミュレーション] をクリックし、[決定論的] を選択して、回路を 100 時間単位でシミュレートします。
コントロールパネルからシミュレーショングラフを調整し、SDHAおよびテトラサイクリン応答性抑制タンパク質のグラフパターンを観察します。標準的な生物学的部品のレジストリを開き、次に検索をクリックして、遺伝的要素の名前を入力します。CMVプロモーターのヌクレオチド配列を取得するには、get part sequenceをクリックし、ファイルをテキストファイルとして保存します。
SDHAのタンパク質コード配列を取得するには、NCBIを開き、検索ウィンドウの横にあるドロップダウンからヌクレオチドを選択します。「コハク酸デヒドロゲナーゼ」と「Mus musculus」と入力し、塩基配列を検索します。CDSオプションをクリックして、SDHAのコーディングシーケンスを取得し、シーケンスをテキストファイルに保存します。
すべての遺伝的調節部分のヌクレオチド配列を1つのファイルに順次マージします。Kozak配列の直後に開始コドンATGを添加し、内部の終止コドンを除去して、新生ポリペプチドの形成を回避します。ExpacyのWebサイトを開き、ヌクレオチド配列を貼り付けます。
「translate the sequence」オプションをクリックし、次に5つの素数3つの素数フレーム1を選択し、終止コドンを削除します。まず、RAW264.7細胞を摂氏37度で90%の密度に達するまで培養します。誘導された合成回路の寄生虫除去効果を決定するために、以下のサンプルを調製します。
25平方センチメートルのフラスコからRAW264.7セルをこすり落とします。細胞懸濁液を300Gで5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのDMEM完全培地に再懸濁します。再懸濁した細胞懸濁液の10マイクロリットルを100マイクロリットルのチューブに移します。
10マイクロリットルの0.5%トリパンブルーを細胞に加え、よく混ぜます。細胞計数チャンバースライドに10マイクロリットルの細胞とトリパンブルーミックスをロードし、4つのチャンバーから細胞数を採取します。カバースリップボトム96ウェルプレートに1ウェルあたり4セルの累乗で10倍を2回プレートし、5%二酸化炭素と摂氏37度で24時間インキュベートします。
6時間の感染サンプルを調製するには、1ミリリットルの固定相リーシュマニアメジャープロマスティゴテスを7,273Gで10分間遠心分離し、ペレットを500マイクロリットルのDMEM完全培地に再懸濁します。カウント後、カバースリップボトム96ウェルプレートの5つのL.majorプロマスタゴテスの累乗に10の2倍を加えます。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と6時間インキュベートします。
インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄します。IMTおよびIMTIサンプルを調製するには、5つのL.major前胸筋の累乗で10の2倍に6時間、12時間、18時間、および24時間増殖します。1.5ミリリットルのチューブに、24マイクロリットルの還元血清培地と1マイクログラムの合成回路プラスミドを追加します。.
別の1.5ミリリットルのチューブに、24マイクロリットルの還元血清培地と1マイクロリットルのポリエチレンイミンまたはPEIを追加します。.少なくとも10回ピペッティングしてよく混ぜ、室温で5分間インキュベートします。PEIミックスをDNAの入った1.5ミリリットルチューブに移し、よく混ぜます。
チューブを10分間インキュベートします。96ウェルカバーのスリップボトムプレートのウェルから培地を捨て、PBSで細胞を3回洗浄します。ピペットを使用して、DNA-PEIミックスを細胞に滴下し、プレートを静かに振とうします。
細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と3時間インキュベートします。次に、200マイクロリットルの新鮮な還元血清培地を細胞に加え、プレートを穏やかに振とうし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、メディアを捨てます。
PBSで細胞を2回洗浄した後、ジェネチシンとドキシサイクリンを含むDMEM完全培地を細胞に加え、24時間インキュベートします。合成回路のシミュレーションにより、SDHAとテトラサイクリンリプレッサーの両方で振動ダイナミクスが明らかになりました。大腸菌DH5-αへの合成回路の導入により、形質転換コロニーがカナマイシンに対する耐性を示し、効率的な形質転換が示されました。
合成回路によるトランスフェクションとドキシサイクリンによる誘導により、IMT細胞におけるGFP発現が経時的に有意に増加しました。トランスフェクション後およびドキシサイクリン誘導後、感染したマクロファージでは細胞内寄生虫負荷の有意な減少が観察されました。インターロイキン10とインターロイキン12のサイトカインレベルは、感染後6時間で最も高く、トランスフェクションと合成回路の誘導に有意差は観察されませんでした。
腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマ、およびトランスフォーミング成長因子ベータの有意な増加が24時間IMTIサンプルで観察され、炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを示しています。
