1。サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRのアッセイデザインアルゴリズム<ol><li> Solarisの定量PCRプローブ/プライマーペアの設計で使用されるアルゴリズムは、それによって普遍的なサイクリングの条件を可能にする各コンポーネントのTmを調整します。 MGBの定款、または副溝結合、プローブの部分は、Tmを増加させ、より大きなアッセイの柔軟性とパフォーマンスのために設計されるため、より短いプローブすることができます。その名前が示すように、MGBsはDNAのらせんの副溝に収まることができる抗生物質のクラスです。 MGBsは、DNAプローブの3または5の端に添付されます。ソリューションでは、プローブのFAMのレポーターの蛍光は、Eclipseダーククエンチャーによりクエンチされる。プローブが標的配列に結合すると、プローブの3次元立体構造の結果としての変化は、強い蛍光シグナルを可能にします。標的配列のDNAプローブの結合は、PCRのための適切な溶融温度を維持しながら、高度に特異的な、より短いプローブの使用を可能にするMGB、によって安定化される。このように、信号検出は、ターゲットの増幅のアニーリング相の間に発生します。拡張ステップの間、MGBプローブは、関連付けを解除して、蛍光は再び急冷する。プローブがアソシエーションを解除するので、それはPCR効率には影響しません。 </li><li> Solarisのアルゴリズムのもう一つの特徴は、Superbasesの使用です。 Superbasesは、債券ATの安定性を向上させ、GGグアニンに富む配列における自己会合を排除するための結合能力を強化している拠点を変更されます。また、彼らは、5末端に接続された隣接する蛍光物質を消光しない。これらの塩基を選択的に標的配列の可用性を拡張するために、アルゴリズムにしたがって、配置されます。これは、そうでない場合はプライマーとプローブを設計する際に避けられるようなGCリッチな領域として配列が、使用することが可能になります。 </li><li>可能な限り、Solarisのアルゴリズムは、ターゲットサイトのエキソン接合貫通領域を内蔵しています。これは、汚染物質ゲノムDNAの増幅を回避することによって特異性を向上させます。 </li><li>重要なのは、このアルゴリズムは、すべてが単一のプローブ/プライマーセットによってカバーされるような既知のすべてのスプライスバリアントのためのコンセンサス配列を、識別する。そう、唯一のアッセイは、興味のある特定の遺伝子のために必要です。 </li><li>最後に、Solarisの定量PCRアッセイの設計アルゴリズムは、GC含量、長さ、Tm値、および均一なヌクレオチドのストレッチなどの重要な設計上の考慮事項のための非常に厳しいパラメータを利用しています。ゲノム、トランスクリプト、および偽遺伝子：結果のシーケンスは、3つの異なるデータベースを使用して特異性のために分析BLASTです。 </li></ol> 2。 Solarisの試薬の入手方法<ol><li>適切なSolarisの試薬 ​​を入手するには、 <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solarisを</a> </li><li>一度Webサイトで&quot;GENEius商品検索&quot;をクリックしてください。 GENEius製品検索へ直接移動するには、を参照してください<a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li>検索照会ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。 </li><li> GENEius製品の検索は、多くの異なる遺伝子の識別子を処理することができます。ここでは、文献[シーケンシャルアク、遺伝子ID、遺伝子シンボル、遺伝子情報、サンガーのIDまたはアクセッション番号、またはカタログ番号を含む、対象の遺伝子を見つけるために提案された検索用語、のいずれかを入力します。その後、&quot;検索&quot;をクリックしてください。 </li><li>目的の遺伝子を特定し、左側の&quot;選択&quot;をクリックしてください。これは、目的の遺伝子のために利用可能な異なるサーモサイエンティフィックの製品を表示するウィンドウを開きます。 &quot;製品&quot;の下に&quot;定量PCRの検出&quot;タブを選択します。 </li><li>見出しの&quot;Solarisの遺伝子発現アッセイ&quot;の下に、最適にSolarisのプローブ/プライマーアッセイを設計したものが表示されます。このアッセイは、遺伝子のターゲットのすべての既知のスプライシングバリアントをカバーします。希望する数量を選択してください。彼らは、100、200、400で提供され、 1000 X 25μlの反応（アッセイはオーダーメイドとして識別されている場合、100枚サイズは使用できなくなります）。 &quot;カートに入れる&quot;をクリックしてください。 </li><li>次に、使用するサーマルサイクラーに適したマスターミックスを選択します。マスターミックスが可能なマシンで最適に動作するかを決定するために、クリックして&quot;マスターミックスは、PCRのサーマルサイクラーで最適な動作するこちらをご覧ください。&quot; </li><li>使用するミックスを決定するためにメニューに使用される定量PCRのサーマルサイクラーを見つける。 </li><li> GENEius製品の検索ウィンドウに戻り、適切なマスターミックスを選択します。マスターミックスは、100、200、400、および1000反応のサイズがあります。 &quot;カートに入れる&quot;をクリックします。 </li><li>推奨リファレンス遺伝子と裏面cDNA合成キットは、完全な定量RT - PCR分析のために注文することができます。 </li><li> Solarisの定量PCR試薬が到着すると、使用直前まで-20℃で保管します。以下の試薬を受信する必要があります：色曲、800 nMの各、200 nmで提供されて一つの遺伝子特異的プローブで提供されている2つのプライマーを含む20倍ソリューションをプローブとプライマー、および2Xの濃度でのSolaris定量PCR遺伝子発現のマスターミックスの両方のレンス情報。 Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、12ヶ月以上安定しています。融解凍結を避けてください。 </li></ol> 3。定量PCRセットアップ<ol><li> cDNAを定量PCRのプロトコルを開始します。トータルRNAをスピンカラム法を用いて抽出する必要があります。サーモフィッシャーサイエンティヴァーソcDNA合成キットはcDNAを生成するために逆転写することをお勧めします。 </li><li>プライマー、プローブ、およびマスターミックスを氷上で融解することによって定量PCRの準備。また、リアルタイムPCRの感度を向上させることができる手PCRグレードの水と不透明な白の定量PCRプレート、上持っている。 </li><li> 1）サーモスタートDNAポリメラーゼ、Thermoprime DNAポリメラーゼのホットスタートバージョン：マスターミックスには含めてリアルタイムPCR用のすべてのコンポーネントが含まれています。ポリメラーゼのこのタイプは、最大反応、設定し、95℃で15分で活性化工程を必要とする時の非特異的増幅を防ぐために使用されます。 2）SolarisのマスターミックスでのdNTPは、dTTPのは、Solarisのプライマー/プローブアッセイで動作するように最適化された独自の反応緩衝増幅効率3）を、最大化するためにdUTPを置き換えます。この反応バッファー、試薬とプラスチックの間のコントラストを高めるために青色色素が含まれています。あなたの定量PCR装置がROX必要とする場合4）ROX、。 </li><li>ソリューションが融解した後、チューブを（ボルテックスしない）フリックで混ぜる。試薬の損失を防ぐために、それらをスピンダウン。 </li><li>次に、サンプル数に応じてスケールアップ、反応の目的遺伝子の組み合わせに加え、リファレンス遺伝子の1つを設定するために15 mLの滅菌ファルコンチューブを準備する。十分な三人レプリケートするよう準備を標準曲線法は、分析のために使用される場合は、テンプレートのコントロール（NTC）と標準曲線のサンプルを含むため、個々のサンプルを用意することができます。 </li><li> 96ウェルプレート上で実行される各サンプルについて、以下のミックス：最終反応容積こと2XのSolaris定量PCRマスターミックス、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）、およびそのようなPCRグレードの水の0.5μlの5μLを、一度cDNAを25μLとなる追加されます。 384ウェルプレート上で実行される各サンプルに対して次のように混在させる：2XのSolaris定量PCRマスターミックスの12.5μL、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）の1.25μL、およびそのようなPCRグレードの水を最終反応容量、一回のcDNAその10μLとなる追加されます。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用して、プレートの適切なウェルにマスターミックスを転送する。マスターミックスに含まれる青い色素は、白色プレート上にピペットで進捗状況を追跡する際に役立ちます。その後、1-5μLのcDNAテンプレート（96ウェルプレートの場合）またはcDNAテンプレートの1〜2μLを（384ウェルプレート用）を追加。ミックスを上下にピペッティングし。遠心分離機にプレートを置き、これらの蛍光測定値に干渉するので、任意の気泡を除去するためにスピンダウン。 </li><li>プログラムは、サーマルサイクラー：酵素は95℃15分（1サイクル）でアクティブにする必要があります。 95その後40サイクル60℃℃、15秒間の変性、及びアニーリングおよび伸長℃（60秒）。 </li><li>定量PCR機器にプレートを置きます。プログラムを起動します。 </li></ol> Solarisを使用して代表的な定量PCRの結果<img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 PCRの効率とr2の値で判断してSolarisのアッセイは、非常に低い入力濃度で信頼性の高い検出を与える。合成RNAアンプリコン配列またはDNAのアンプリコン配列から合成したcDNAの十10倍希釈液をそれぞれF2RL1またはCDC20、のためのSolaris定量PCRの遺伝子発現アッセイを用いてABI 7900HT楽器で増幅した。対数増幅曲線と標準曲線は、効率性、R2の値は、10 log10の希釈液の外ダイナミックレンジ、および検出の下限値を含む各アッセイの性能と一緒に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 Solarisのアッセイは、さらに別の研究者と研究所間の一貫性のある結果を与える。 ALDOAとPPIBだけでなく、非標的コントロール（NTC）をターゲットにしたsiRNAは、100、10、1、0.1 nMの終濃度でHeLa細胞にトランスフェクションした。細胞を採取し、全RNAは、48時間後の治療を単離した。 cDNAは、サーモフィッシャーサイエンティヴァーcDNA合成キットを用いて合成した。 cDNAのアリコートをロシュクラー480（384）プラットフォーム上でALDOA、PPIB、およびGAPDHの検出のためのSolaris定量PCR遺伝子発現アッセイを使用して、2つの地理的に離れた研究室で増幅した。ノックダウンはΔΔCq法（GAPDHリファレンス遺伝子とNTC処理細胞に規格化）を用いて算出した。ノックダウンの同じレベルは、両方のサイトの両方の研究者との間の遺伝子標的の両方で実証された。

この記事の著者は、サーモサイエンティフィックの従業員です。

サーモサイエンティフィックのSolaris qPCRアッセイは、qPCR解析を実行するための簡単​​な、改良された方法を提供する。 MGB技術とSuperbasesを組み込んだ、高ストのアルゴリズムを使用して、これらプライマーおよびプローブセットは、定量PCR実験の忠実性と堅牢性を最大化する。一のプライマーおよびプローブセットは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを認識する。ターゲットサイト、可能な限りは、ゲノムDNAが増幅されていないことを保証するために、エクソンにまたがる領域を含む。これらの機能は大幅に複雑な実験を実行するために必要な時間の量を減らすこと、同時に多数のサンプルを実行することが可能に。マスターミックスは青なので、ピペッティングのトラックを失うことなく、定量PCRの感度を向上させる白色不透明プレートを、使用することが可能です。 すべて一緒になって、Solarisの定量PCRアッセイのデザインの特徴は、この小説定量PCRアッセイの特定と、堅牢かつシンプルな、まだ高性能なアッセイを行う。

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの感度および精度を維持しながら、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計されたプライマー/プローブセットの新しいタイプです。これらのプライマー/プローブセットは、以前は利用可能な技術からヒトとマウスのゲノムと機能の大幅な改善の&gt; 98％に予め設計されています。これらの改善は、サーモフィッシャーサイエンティバイオインフォマティクスの専門家によって開発された斬新なデザインのアルゴリズム、のおかげで可能にした。 いくつかの便利な機能が定量的リアルタイムPCRを行うのプロセスを合理化するためのSolaris定量PCRアッセイに組み込まれています。最初に、プロトコルは、一般的に用い選択肢に似ていますが、その定量PCR中に使用される方法は精通している可能性があります。第二に、マスターミックスは、追跡するために、定量PCRの反応は、設定を容易になる、青です。第三に、熱サイクル条件は、すべてのアッセイ（遺伝子）、それは可能な限り一度に多くのサンプルを実行することやエラーの可能性を減少させるための同じです。最後に、プローブとプライマーの配列情報は、公開プロセスを簡素化、提供されています。 ここでは、ご注文のウェブサイト（www.thermo.com / Solaris）上で、どのように標準曲線法を用いてqPCRを行うためのSolarisの試薬を使用するために見つけたGENEius製品検索機能を使用して適切なSolarisの試薬を取得する方法を示します。

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの特異性と堅牢性を犠牲にすることなく、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計された斬新なデザイン済みの定量PCRプライマー/プローブの組み合わせです。

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

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ビデオ: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

生物学

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...