この作品は、部分的にERANET +プロジェクトLUSバブルとBI-TREの枠内Regioneトスカーナと欧州共同体によってサポートされていました。

注：金ナノロッドの全ての濃度は、公称のAuモル濃度で表されています。他の作品との比較のために、1 M Auをおおよそ我々の場合には、20μMの金ナノロッドに対応していることに注意してください。 カチオン性金ナノロッドの作製注：この方法は、Ratto ら 26に従ってNikoobakht ら 25によって導入され、適応プロトコルに従って、アスコルビン酸とのHAuCl 4の自己触媒還元によるセトリモニウムブロマイド（CTAB）-capped金ナノロッドの合成を開始します。これらの金ナノロッドは、ポリエチレングリコールの組み合わせ10、11、27、28及び第四級アンモニウム化合物22を鎖によって、血漿膜のためのより多くの生体適合性および親和性を得るために変更されます。 <ol><li> concentratioで24ミリリットルCTABをかぶった金ナノロッドを精製遠心分離の2つのサイクル（12,000×gで、30分）し、デカンテーションによって、450μMのAuのn個。初期体積へのデッドボリュームの比率は、このプロトコルですべての遠心操作のために周りの1/200以下であることを確認します。洗浄液として、500μMの水性CTABを使用し、最終的に500μMCTAB及び0.005％（v / v）のポリソルベート20を含むpHが5で6ミリリットルの100mM酢酸緩衝液中に粒子を移します。 </li><li> 30μlの10mMの水性アルファ - メトキシ - オメガ - メルカプト - ポリ（エチレングリコール）（MW〜5,000）を加え、37℃で30分間反応さ残します。 </li><li>ジメチルスルホキシド、N、N、N -トリメチルアンモニウムブロマイド、37℃で24時間安静に残す- 30μlの100 mMの（11-メルカプトウン）を追加します。 </li><li>次に、水18 mlの0.005％（v / v）のポリソルベート20を追加して、遠心分離の4サイクル（12,000×gで、30分）、デカンテーションすることによって、これらの粒子を精製します。洗浄液として、水に0.​​005％（v / v）のポリソルベート20を使用して、最終的にpHで2.4 mlの滅菌PBS中に粒子を移します7.4。金の最終名目濃度は4.5 mmです。 </li></ol>ゴールドナノロッドとマウスマクロファージの2のロード<ol><li> J774A.1し、DMEM、10％ウシ胎児血清、1 mMグルタミン、100単位/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンのような培養培地を補充した単球/マクロファージ細胞株を使用してください。プレート直径60mmの4ペトリ皿中で5×10 5細胞及び剥離時のサブコンフルエントするように彼らは、24時間成長させる（ステップ2.2参照）。 <ol><li>プロトコルを通して、標準培養条件（37℃、5％CO 2、95％空気および100％相対湿度）で細胞を維持します。細胞を操作するためにクリーンベンチ、適切な個人用保護具を使用します。 </li></ol></li><li> 24時間後、キトサンフィルムに埋め込まれるように、カチオン性金ナノロッドで細胞をロードし、それらを準備します。 <ol><li>粒子が細胞によって取り込まれることを可能にするために、4.5のアリコートを加えます各ペトリ皿にmMのPBS中のAuのカチオン性金ナノロッドは、100μMのAuの最終濃度を達成するようになっています。 24時間のインキュベーションにペトリ皿のままにしておきます。 </li><li>次に、それらの良好な条件とアップロードを確認するために、光学顕微鏡で細胞を観察します。細胞は、その正常な形態と暗細胞内小胞の数を示すべきです。以下の工程（少なくとも2×10 6細胞）を、細胞の適切な量を達成するために、2つのペトリ皿からそれらをマージし、スクレーパによって細胞を剥離し、いずれかを排除するためにそれら（120×gで6分間）遠心カチオン性金ナノロッドの過剰。携帯ペレットはほとんど黒になります。 </li><li> 2mlのPBSでペレットを中断し、Bürker室を利用して細胞を数えます。遠心分離機2×10 6個の細胞（120×gで、6分）し、室温で10分間、PBS中のホルムアルデヒド（w / v）の2ミリリットル3.6％で、そのペレットを修正を含む懸濁液。最後に、centrifugatすることにより、このペレットを3回洗浄固定液を除去するためにイオン（120×gで、6分）。洗浄液としてPBSを使用してください。 </li></ol></li></ol>キトサンフィルムへのマクロファージの3埋め込み注：キトサン26、27、28の固有の特性、29はカチオン性金ナノロッドを用いて染色したマクロファージを含有する生体模倣ファントムを生成するために利用されます。アガロースなどの他のヒドロゲルに関しては、キトサンは、PA顕微鏡6のために重要である、はるかに強いと薄いフィルムを可能にします。これらのファントムの製造は、以下の30の規定にいくつかの変更を加えて31、以前のプロトコル29、30に従って行われます。 <ol><li>酸性化した（酢酸の添加により得られるpHは4.5）及び粘性を3％（w / v）の低分子量のキトサン（平均分子量120 kDaの）溶液を調製し、十分に混合しそれは40℃で24時間均質化させ。 </li><li>次に、キトサン溶液500μlを有するカチオン性金ナノロッド（2×10 6細胞）を含む、マウスのマクロファージを混ぜます。 </li><li> 、〜50μm厚のファントムを得る1.91センチメートル2ポリスチレン型に混合物の250ミリグラムを注ぎ、24時間窒素気流下でそれらを残すために。その後、架橋を誘導するために、500μlの1 M NaOHを用いてこれらのサンプルを処理し、超純水10mlでそれらをすすぎます。 </li></ol>光音響変換の安定性4.テスト注：PA変換の安定性は、参考文献6に記載されている自家製のセットアップとPA実験によって調べました。 <ol><li>プレートの底から〜5mmの間隔を保つように、ペトリ皿に浸漬プラスチックホルダーを使用することによって、例えば脱イオン水でマクロファージを含むキトサンフィルムを、サスペンド。このプレートは、マイクロメートルのXYステージ上に置きます試料の位置を制御するためです。 </li><li> 2500 - 400の波長範囲でYAGレーザー：QスイッチNdの第三高調波で励起光パラメトリック発振器から、 例えば、金ナノロッド（の縦プラズモンバンドと共鳴〜5ナノ秒のパルス持続時間を有するレーザービームをフォーカス〜300μmのスポット径を有する膜面に垂直nmおよび5ナノ秒のパルス持続時間）。 <ol><li>レーザフルエンス調整するために、レーザー出口の前に減衰器を配置し、エネルギーメーター（ 例えば 、焦電検出器）にレーザービームの一部を集中し、フルエンスの変動を監視するために、ビームスプリッタを使用しています。アライメント時パルスあたり〜1ミリジュール/ cm 2の下の光フルエンスを維持します。レーザーがオンになっていれば、適切なレーザー安全メガネを使用してください。 </li></ol></li><li>フィルム表面から約2 mmのペトリ皿に及びマイクロメートルの翻訳を使用してその位置を調整する - 超音波振動子（20から1MHzの周波数範囲）に浸し回転ステージは、膜から放出されたPA信号を最大化します。 </li><li>試料6に損傷を与えないプローブフルエンスF LOを決定します。 <ol><li> 1 MJ /少なくとも500パルスのパルス当たりcm 2の周りのフルエンスでサンプルのランダム点を照射します。各パルスは、オシロスコープと電力量計からの超音波トランスデューサとレーザフルエンスから対応するPA信号を取得します。 F LO トライアルとして平均フルエンスに名前を付けます。 </li><li>パルス数の関数としてのピーク・ツー・ピーク振幅としてPA信号の強度を算出します。レーザ強度の変動をカウンタウエイトにするために、F LO 試験への独自のフルエンスの割合各PA信号の振幅を正規化します。パルス数の関数としての正規化されたPAの強度の傾向を分析し、時間をかけてその安定性を検証します。 </li><li>不安定性の場合には、繰り返しはF LOの低い値と4.4.3に4.4.1ステップ<s&gt;裁判アップ。安定性の損失が発生するまで、安定性の場合には、〜10％高いF LO 試験の値でそれらを繰り返します。安定性を保証F LO 試験の二番目に高い値としてプローブフルエンスF LOを設定します 。 </li></ol></li><li>整形閾値フルエンスを測定します。 <ol><li>サンプルの別のランダム点を選択し、平均PA強度F LOで（I LO a）は、500を超えるパルスを探ります。 </li><li> F LOよりも大きい公称フルエンスを設定し、50パルスを提供します。 F EXCとしての平均フルエンスに名前を付けます。 </li><li>プローブ再びF LOで500パルスにわたって平均PA強度（I LO b）は 。比R = I LOの B / I LO計算します。団結以下のRの値は、サンプルの光学特性の不可逆的な変化の証拠を提供します。 </li><li>フィルムを移動させるために、マイクロメートルXYステージを使用して、POINを変更ランダムにサンプルのトン。周りと団結の上、下記のRのいくつかの値をとるように繰り返して、F EXCの異なる値と4.5.4に4.5.1を繰り返します。 15点が妥当です。 </li><li> FのEXCの関数としてプロットRおよびRは、統計的不確実性を超えたものと異なるし始めると、その値として番目の整形の閾値フルエンスFを識別します。6 </li></ol></li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

腫瘍関連マクロファージを標的とする概念は、癌34、35、36に対抗するために強力な概念として浮上しています。ここでは、代わりにその破壊のために、これらの細胞は、その親和性の活用により、腫瘍に金ナノロッドをもたらすために携帯車として採用されています。この視点は、粒子の思慮深い設計、細胞とその特性評価への統合を必要とします。...

過去10年間、金ナノロッド、ナノシェル及びナノケージ等の種々のプラズモニック粒子は、生物医学的光学系1、2、3、4における用途のために、かなりの注目を集めています。標準の金ナノスフィアと分散では、これらの新しい粒子が身体を通して最も深い光浸透し、内因性の構成要素1を超える最高の光学コントラストを提供し、近赤外（NIR）ウィンドウで共振します。この機能は、光音響（PA）イメージングおよび癌の光熱アブレーションなど革新的なアプリケーションのための関心を呼んでいます。しかし、いくつかの問題は、これらの粒子の臨床的浸透を抑制する。例えば、それらの光活性化は、その過熱を誘導するために、より球状photoinstability 5を駆動プロファイル、6、7、8に向かってそれらの機能的形状を変更する傾向があります</SUP&gt;、9。科学的な議論を支配するもう一つの問題は、腫瘍へのそれらの全身送達です。具体的には、金ナノロッドは、強化された透過性と保持および悪性マーカーの特異的プローブとの結合の容易さを表示する腫瘍に浸透するのが理想的であるサイズを兼ね備えています。従って、血流への直接注射のためのそれらの調製が可能スキーム10、11、12、13として知覚されます。しかしながら、この経路は、粒子の大部分は、単核食細胞系10、11、12により捕捉さになって、問題が残ります。また、別の懸念は、本体14を通って循環した後の粒子の光学的および生化学的安定性です。粒子は、それらのコロイド安定性と凝集体を失うとき、彼らのプラズモニック機能や伝熱力学は、プラズモニックカップリング15に苦しむことがあり、 </s&gt; 16、17、最大18クロス過熱。 より最近では、腫瘍関連マクロファージの親和性を利用する概念は、スマート代替19、20、21として浮上しています。これらの細胞は、高い特異性で腫瘍を検出し、みなぎるする生得的な能力を保持します。したがって、1観点は、患者からこれらの細胞を単離し、in vitroでの金ナノロッドでそれらをロードし、配達を担当する携帯車としてそれらを使用することを意図して、患者に戻ってそれらを注入することであってもよいです。もう一つの利点は、それらの生物学的インタフェースをin vitroで構築されるため、粒子の光学的および生化学的安定性をより細かく制御を獲得することです。それでも、光造影剤としてのこれらの細胞の車両の性能は、批判的な分析を必要としています。 本研究では、準備とcellulの重要な問題について説明します癌のPAイメージングのための金ナノロッドを含むAr車。 PEG化された金ナノロッドは、血漿膜23,24との相互作用を促進することが期待されているカチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物22で修飾されています。これらの粒子は、うまくいけば、それらの生物学的機能をあまり干渉することなく、ほとんどの携帯の種類の中から効率的かつ非特異的取り込みを受けます。マウスマクロファージはタイトエンドサイトーシス小胞内に閉じ込めなっセルあたり最大000、200のようなカチオン性金ナノロッド、までにロードされます。この構成は、これらの小胞の内部のプラズモンカップリングとクロス過熱の恐れの、懸念を生じなければなりません。したがって、マクロファージは、粒子のPA転化の安定性の大部分はエンドサイトーシス小胞の成長培地からの転送中に保持されていることを確認するために、生体組織を模倣する生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています。 EffectivEの測定基準は、PAイメージングのための即時の関心の条件下でPA変換の安定性を測定するために働いています。再形成閾値は10ヘルツの典型的な繰り返し率を有する50のレーザパルス列の後に、光不安定性の非常に開始時に設定されています。 私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための勢いを提供することができることを確信しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

金ナノロッドは、腫瘍への家庭への近赤外窓、低細胞毒性および電位の彼らの強烈な光吸収率のおかげで、このような光熱アブレーションおよび癌の光音響イメージングなどの生物医学的用途の範囲のために魅力的です。しかし、腫瘍への配信はまだ問題が残っています。革新的なアプローチは、in vitroでの金ナノロッドを装填できる腫瘍関連マクロファージの親和性の搾取から構成されています。ここでは、準備金ナノロッドを含む細胞の車両の光音響検査について説明します。 PEG化された金ナノロッドは、カチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物で修飾されています。通常のペトリ皿におけるマウスのマクロファージと接触すると、これらの粒子は、エンドサイトーシス小胞に大量の取り込みを受けることが分かっています。次に、これらの細胞は、その音響変換の安定性を確認するために使用される生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています粒子の携帯車へのそれらの包含に保持されています。私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための新たなインスピレーションを提供することができることを確信しています。

ここでは、癌のPAイメージングのために金ナノロッドを含む細胞の車の可能性は、プロトコルの代表的な成果と一緒に示されています。 図1のTEM画像は、ステップ2の粒子のとTEMイメージングのための細胞の調製は、別の場所で17説明された後、ステップ1後の粒子およびそれらの細胞の車の通常の外観?...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K ビュー.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

生物工学

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

統合された光音響眼底検査とスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

光音響膀胱造影

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

マクロを含む光の組織ファントムの作製と評価

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...