Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla Regione Toscana e della Comunità Europea all&#39;interno della cornice della bolla ERANET + Progetti LUS e BI-TRE.

Nota: Tutte le concentrazioni di nanotubi d&#39;oro sono espressi in termini di molarità nominali Au. Per il confronto con altre opere, di notare che 1 M Au corrisponde approssimativamente a 20 micron nanotubi d&#39;oro, nel nostro caso. 1. Preparazione di cationici oro Nanorods Nota: Il metodo inizia con la sintesi di bromuro cetrimonio (CTAB) nanorods oro -capped dalla riduzione autocatalitica di HAuCl4 con acido ascorbico, secondo il protocollo introdotto da Nikoobakht et al 25 e adattato secondo Ratto et al 26... Poi questi nanorods oro sono modificate in modo da ottenere più biocompatibilità e affinità per le membrane plasmatiche, dalla combinazione di polietilenglicole trefoli 10, 11, 27, 28 e composti di ammonio quaternario 22. <ol><li> Purificare 24 ml nanotubi d&#39;oro CTAB-capped a concentration di 450 pM Au da due cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Assicurarsi che il rapporto tra volume morto al volume iniziale è di circa 1/200 o inferiore per tutte le fasi di centrifugazione di questo protocollo. Utilizzare 500 pM acquosa CTAB come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 6 ml 100 mM tampone acetato a pH 5, contenente 500 mM CTAB e 0,005% (v / v) polisorbato 20. </li><li> Aggiungere 30 microlitri 10 mM acquosa alfa-metossi-omega-mercapto-poli (etilene glicole) (MW ~ 5000) e lasciare reagire per 30 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro -trimethylammonium in dimetilsolfossido e lasciare a riposo per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Successivamente, aggiungere 18 ml 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua e purificare queste particelle da quattro cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Utilizzare 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 2,4 ml di PBS sterile a pH7.4. La concentrazione nominale finale di oro è di 4,5 mm. </li></ol> 2. Caricamento di murini macrofagi con oro Nanorods <ol><li> Utilizzare la / linea cellulare macrofagica monociti J774a.1 e DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino, 1 mM glutammina, 100 unità / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina come mezzo di coltura. Piastra 5 x 10 5 cellule in quattro piastre di Petri di 60 mm di diametro e consentire loro di crescere per 24 ore, in modo da essere subconfluenti al momento del distacco (vedi punto 2.2). <ol><li> In tutto il protocollo, di mantenere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO 2, aria 95% e il 100% di umidità relativa). Utilizzare una cappa a flusso laminare e dispositivi di protezione adeguati per manipolare le cellule. </li></ol></li><li> Dopo 24 ore, caricare le cellule con nanotubi d&#39;oro cationici e prepararli per essere incorporato in film chitosano: <ol><li> Per consentire alle particelle di essere assunti dalle cellule, aggiungere una aliquota di 4,5mM Au nanotubi d&#39;oro cationico in soluzione in ciascuno piastra di Petri, in modo da raggiungere una concentrazione finale di 100 micron Au. Lasciare le piastre di Petri in incubazione per 24 ore. </li><li> Successivamente, osservare le cellule al microscopio ottico per confermare le loro buone condizioni e il caricamento. Le cellule devono esibire loro normale morfologia e un certo numero di vescicole intracellulari scuri. Staccare le cellule con un raschietto, unire quelli da due piastre di Petri, al fine di ottenere una quantità adeguata di cellule per i seguenti passi (almeno 2 x 10 6 cellule), e centrifugare loro (120 xg, 6 min) per eliminare qualsiasi eccesso di nanotubi d&#39;oro cationici. Il pellet cellulare dovrebbe apparire quasi nero. </li><li> Sospendere il pellet in 2 ml di PBS e contare le cellule mediante l&#39;uso di una camera di Bürker. Centrifugare una sospensione contenente 2 x 10 6 cellule (120 xg, 6 min) e fissare il pellet in 2 ml di 3,6% (w / v) di formaldeide in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare questo pellet tre volte da centrifugation (120 xg, 6 min) per rimuovere il fissativo. Usa PBS come soluzione di lavaggio. </li></ol></li></ol> 3. Radicamento dei macrofagi in Chitosano Cinema Nota: Le proprietà peculiari del chitosano 26, 27, 28, 29 sono sfruttati per la produzione di fantasmi biomimetici contenenti macrofagi colorati con nanotubi d&#39;oro cationici. Rispetto ad altri idrogel come agarosio, chitosano permette film che sono molto più forte e più sottile, che è fondamentale per la microscopia PA 6. La fabbricazione di questi fantasmi viene effettuata secondo precedenti protocolli 29, 30, 31 con alcune modifiche come prescritto nelle seguenti 30. <ol><li> Preparare una acidificata (pH 4,5, ottenuto mediante aggiunta di acido acetico) e viscosa 3% (w / v) a basso peso molecolare chitosano (MW medio 120 kDa) soluzione, mescolare bene elasciate omogeneizzare per 24 ore a 40 ° C. </li><li> Avanti, mescolare macrofagi murini contenenti nanotubi d&#39;oro cationico (2 x 10 6 celle) con 500 ml di soluzione di chitosano. </li><li> Per ottenere ~ 50 micron di spessore fantasmi, versare 250 mg del composto in 1,91 cm 2 stampi polistirolo e lasciarli sotto flusso di azoto per 24 ore. Successivamente, trattare questi campioni con 500 microlitri 1 M NaOH, per indurre reticolazione, e sciacquare con 10 ml di acqua ultrapura. </li></ol> 4. Prova di stabilità di conversione Fotoacustica Nota: La stabilità della conversione PA è indagato per mezzo di esperimenti di PA con la configurazione fatta in casa, che è descritto in rif 6. <ol><li> Sospendere un film chitosano contenente macrofagi in acqua deionizzata, per esempio mediante l&#39;uso di un supporto di plastica immerso in una capsula di Petri, in modo da mantenere una distanza di ~ 5 mm dal fondo della piastra. Mettere questo piatto su un palco XY micrometricaal fine di controllare la posizione del campione. </li><li> Primo un fascio laser con ~ 5 durata nsec impulsi in risonanza con la banda plasmonica longitudinale dei nanotubi oro (ad esempio, da un oscillatore parametrico ottico pompato dalla terza armonica di un Nd Q-switched: YAG con lunghezza d&#39;onda di 400 - 2,500 durata dell&#39;impulso nm e 5 nsec) perpendicolare alla superficie del film con un diametro dello spot ~ 300 micron. <ol><li> Inserire un attenuatore di fronte all&#39;uscita del laser per sintonizzare la fluenza laser e utilizzare un divisore di fascio di concentrare parte del fascio laser per un contatore di energia (per esempio, un rilevatore piroelettrico) e monitorare fluttuazioni di fluenza. Mantenere la fluenza ottica sotto ~ 1 mJ / cm 2 per impulso durante l&#39;allineamento. Utilizzare appropriata occhiali di sicurezza laser ogni volta che il laser è acceso. </li></ol></li><li> Dip un trasduttore ad ultrasuoni (gamma di frequenza di 1 - 20 MHz) nella piastra Petri ~ 2 millimetri fuori della superficie della pellicola e regolarne la posizione utilizzando definizioni micrometricie fasi di rotazione per massimizzare il segnale PA emesso dal film. </li><li> Determinare un influenza sonda F LO che non danneggia il campione 6: <ol><li> Irradiare un punto a caso del campione ad una fluenza circa 1 mJ / cm 2 per impulso per almeno 500 impulsi. Per ogni impulso, acquisire il segnale PA corrispondente dal trasduttore ultrasonico e fluenza laser dal contatore di energia con un oscilloscopio. Assegnare un nome alla fluenza media come prova F LO. </li><li> Calcolare l&#39;intensità del segnale PA come ampiezza picco-picco in funzione del numero di impulsi. Per controbilanciare le fluttuazioni di intensità laser, normalizzare l&#39;ampiezza di ciascun segnale PA al rapporto tra la propria fluenza a processo F LO. Analizzare l&#39;andamento dell&#39;intensità normalizzato PA in funzione del numero di impulsi e verificare la stabilità nel tempo. </li><li> Nel caso di instabilità, ripetere i punti 4.4.1 a 4.4.3 con un valore inferiore di F LO <sup&gt; trial. Nel caso di stabilità, ripeterli con un valore di processo F LO maggiore di circa 10%, fino manifestarsi di una perdita di stabilità. Impostare la sonda fluenza F LO come il secondo valore più alto di tentativi F LO che assicura stabilità. </li></ol></li><li> Misurare una soglia fluenza rimodellamento: <ol><li> Scegliere un altro punto a caso del campione e la sonda un&#39;intensità media PA (I LO a) superiore a 500 impulsi a F LO. </li><li> Impostare un fluenza nominale superiore a F LO e fornire 50 impulsi. Nome loro influenza media come F exc. </li><li> Sonda un&#39;intensità media PA (I LO b) più di 500 impulsi a F LO ancora una volta. Calcolare il rapporto R = I LO b / I LO a. Un valore di R al di sotto dell&#39;unità testimonia un cambiamento irreversibile delle proprietà ottiche del campione. </li><li> Utilizzare il palco micrometrica XY per spostare il film e cambiare il point del campione a caso. Ripetere i punti 4.5.1 a 4.5.4 con diversi valori di F esc, in modo da prendere un paio di valori di R sotto, intorno e sopra l&#39;unità. 15 punti sono ragionevoli. </li><li> Plot R in funzione di F exc e identificare la soglia rimodellamento fluenza F th come tale valore quando R inizia a differire da quello oltre incertezza statistica. 6 </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La nozione di indirizzare i macrofagi associati al tumore sta emergendo come un concetto potente per combattere il cancro 34, 35, 36. Qui, invece della loro distruzione, queste cellule vengono reclutati come veicoli cellulari per portare nanotubi d&#39;oro in un tumore, dallo sfruttamento del loro tropismo. Questa prospettiva richiede una progettazione attenta delle particelle, la loro integrazione nelle cellule e la loro caratterizzazione. Abbiamo trovato che la fo...

Negli ultimi dieci anni, varie particelle plasmoniche, come nanotubi d&#39;oro, nanoshells e nanocages, hanno ricevuto una notevole attenzione per le applicazioni in ottica biomedica 1, 2, 3, 4. In contrasto con nanosfere oro standard, queste particelle filtrate risuonano nella finestra vicino infrarosso (NIR) che prevede più profonda penetrazione ottica attraverso il corpo e alto contrasto ottico sui componenti endogene 1. Questa caratteristica ha destato l&#39;interesse per applicazioni innovative, come il fotoacustico (PA) imaging e l&#39;ablazione fototermica di cancro. Tuttavia, diversi problemi frenano la penetrazione clinica di queste particelle. Per esempio, la loro attivazione ottica tende ad indurre il loro surriscaldamento e modificare le loro forme funzionali verso profili più sferiche, che controlla una fotoinstabilità 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Un altro problema che domina il dibattito scientifico è la loro consegna sistemica in tumori. In particolare, nanotubi d&#39;oro si combinano dimensioni che sono l&#39;ideale per pervadere tumori che mostrano una maggiore permeabilità e ritenzione e la facilità di coniugazione con sonde specifiche di marcatori maligni. Pertanto, la loro preparazione per iniezione diretta nel flusso sanguigno è percepito come un regime fattibile 10, 11, 12, 13. Comunque, questa via rimane problematica, con la maggior parte delle particelle diventando catturati dai fagociti mononucleati 10, 11, 12. Inoltre, un&#39;altra preoccupazione è la stabilità ottica e biochimica delle particelle dopo la circolazione attraverso il corpo 14. Quando le particelle perdono la loro stabilità colloidale e di aggregazione, le loro caratteristiche plasmoniche e dinamiche di trasferimento di calore possono soffrire di accoppiamento plasmoniche 15, </sup&gt; 16, 17 e cross-surriscaldamento 18. Più recentemente, l&#39;idea di sfruttare il tropismo di macrofagi associati al tumore è emerso come un&#39;alternativa intelligente 19, 20, 21. Queste celle contengono una innata capacità di rilevare e pervadere i tumori con elevata specificità. Pertanto, una prospettiva potrebbe essere quella di isolare queste cellule da un paziente, caricarli con nanotubi d&#39;oro in vitro e poi iniettare di nuovo nel paziente, con l&#39;intento di usarli come veicoli cellulari responsabili della consegna. Un altro vantaggio sarebbe quello di ottenere un maggiore controllo sulla stabilità ottica e biochimico delle particelle, in quanto la loro interfaccia biologica sarebbe costruita in vitro. Ancora, le prestazioni di questi veicoli cellulari come agenti di contrasto ottici hanno bisogno di una analisi critica. In questo lavoro, si descrive la preparazione e criticità di Cellulveicoli ar contenenti nanotubi d&#39;oro per la formazione immagine PA di cancro. Nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario 22, al fine di ottenere un profilo cationico che si prevede di promuovere le loro interazioni con membrane plasmatiche 23, 24. Queste particelle subiscono l&#39;assorbimento efficiente e aspecifica dalla maggior parte dei tipi cellulari, si spera senza interferire molto con le loro funzioni biologiche. macrofagi murini sono caricati con un massimo di ben 200, 000 nanotubi d&#39;oro cationici per cella, che diventano trovino all&#39;interno di vescicole endocytic stretti. Questa configurazione dovrebbe sorgere preoccupazione, a causa della minaccia di accoppiamento plasmoniche e cross-surriscaldamento all&#39;interno di queste vescicole. Pertanto, i macrofagi sono incorporati in idrogel biopolimerico che imitano i tessuti biologici, per verificare che la maggior parte della stabilità della conversione PA delle particelle è trattenuto nel trasferimento dal mezzo di crescita per le vescicole endocitiche. effectivcriteri di valutazione e sono elaborati al fine di misurare la stabilità della conversione PA in condizioni di immediato interesse per l&#39;imaging PA. Una soglia rimodellare è impostato per lo insorgenza di instabilità ottica dopo un treno di 50 impulsi laser con la frequenza di ripetizione tipica di 10 Hz. Siamo certi che questi risultati possono fornire lo slancio per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

nanorods oro sono attraenti per una gamma di applicazioni biomediche, quali l&#39;ablazione fototermica e di imaging fotoacustico di cancro, grazie alla loro assorbanza ottica intensa nella finestra vicino infrarosso, bassa citotossicità e potenziale per casa in tumori. Tuttavia, la loro consegna ai tumori rimane ancora un problema. Un approccio innovativo consiste dello sfruttamento del tropismo di macrofagi associati al tumore che può essere caricato con nanotubi oro in vitro. Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;ispezione dei veicoli fotoacustica cellulari contenenti nanotubi d&#39;oro. nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario, per ottenere un profilo cationico. A contatto con macrofagi murini in piatti ordinari Petri, queste particelle si trovano a subire massiccia diffusione in vescicole endocytic. Poi queste cellule sono incorporati in idrogel biopolimerico, che vengono utilizzati per verificare che la stabilità della conversione fotoacusticadelle particelle viene mantenuto il loro inserimento in veicoli cellulari. Siamo certi che questi risultati possono fornire nuovi spunti per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

Qui, la fattibilità di veicoli cellulari contenenti nanotubi d&#39;oro per la formazione immagine PA del cancro è mostrato insieme a risultati tipici di protocollo. Le immagini TEM in figura 1 mostra il solito aspetto delle particelle dopo il punto 1 e dei loro veicoli cellulari dopo il punto 2. La preparazione delle particelle e delle cellule per l&#39;imaging TEM è descritto altrove 17. nanotub...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Views.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d&#39;analisi per Knife-edge Microscopia Scansione

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrato oftalmoscopia fotoacustico e Spectral-dominio Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Cistografia fotoacustico

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Preparazione e analisi di<em&gt; In Vitro</em&gt; Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabbricazione e caratterizzazione dei fantasmi di tessuto ottico contenente macrostruttura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...