Name: preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise von der Region Toskana und der Europäischen Gemeinschaft im Rahmen des ERANET + Projekte LUS BUBBLE und BI-TRE unterstützt.

Hinweis: Alle Konzentrationen von Gold-Nanostäbchen werden in Form von nominal Au Molarität ausgedrückt. Zum Vergleich mit anderen Arbeiten zu beachten, dass 1 M Au entspricht in etwa 20 &amp; mgr; M Gold-Nanostäbchen, in unserem Fall. 1. Herstellung von kationischen Gold-Nanostäbchen Hinweis: Das Verfahren beginnt mit der Synthese von Cetrimoniumbromid (CTAB) -capped Gold - Nanostäbchen durch die autokatalytische Reduktion von HAuCl 4 mit Ascorbinsäure, entsprechend dem Protokoll , das von Nikoobakht eingeführt et al 25 und angepasst gemäß Ratto et al 26... Dann werden diese Gold - Nanostäbchen modifiziert , um für plasmatischen Membranen mehr Biokompatibilität und Affinität zu gewinnen, die durch die Kombination von Polyethylenglykol Stränge 10, 11, 27, 28 und quartären Ammoniumverbindungen 22. <ol><li> Reinige 24 ml CTAB-capped Gold-Nanostäbchen an einem concentration von 450 uM Au durch zwei Zyklen von Zentrifugation (12.000 xg, 30 min) und Dekantierung. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Totvolumen Anfangsvolumen liegt bei etwa 1/200 oder weniger für alle Zentrifugationsschritte in diesem Protokoll. Verwenden 500 &amp; mgr; M wässrigen CTAB als Waschlösung und übertragen schließlich die Teilchen in 6 ml 100 mM Acetatpuffer bei pH 5, enthaltend 500 uM CTAB und 0,005% (v / v) Polysorbat 20. </li><li> Zugabe von 30 &amp; mgr; l 10 mM wässrige alpha-methoxy-omega-mercapto-poly (ethylenglykol) (MW ~ 5000) gestellt und für 30 min bei 37 ° C zu reagieren. </li><li> Zugabe von 30 &amp; mgr; l 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N - trimethylammonium - bromid in Dimethylsulfoxid und verlassen in Ruhe für 24 h bei 37 ° C. </li><li> diese Partikel durch vier Zyklen von Zentrifugation (12.000 xg, 30 min) und Dekantierung Nächstes fügen 18 ml 0,005% (v / v) Polysorbat 20 in Wasser und zu reinigen. Verwenden 0,005% (v / v) Polysorbat 20 in Wasser als Waschlösung und übertragen schließlich die Partikel in 2,4 ml steriler PBS bei pH7.4. Die endgültige Soll-Konzentration von Gold beträgt 4,5 mM. </li></ol> 2. Laden von murinen Makrophagen mit Gold-Nanostäbchen <ol><li> Verwenden, um die Monocyten / Makrophagen-Zelllinie J774A.1 und DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin als Kulturmedium. Platte 5 x 10 5 Zellen in vier Petrischalen von 60 mm Durchmesser und lassen sie für 24 h wachsen, so wie zum Zeitpunkt der Ablösung subkonfluenten werden (siehe Schritt 2.2). <ol><li> Während des gesamten Protokolls beibehalten , die Zellen unter Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luft und 100% relativer Luftfeuchtigkeit). Verwenden Sie einen Laminarflowbox und geeignete persönliche Schutzausrüstung, um die Zellen zu manipulieren. </li></ol></li><li> Nach 24 Stunden laden, um die Zellen mit kationischen Gold-Nanostäbchen und bereiten sie in Chitosanfilme eingebettet werden: <ol><li> Um die Partikel zu ermöglichen, die von den Zellen aufgenommen zu werden, fügen Sie eine aliquote Menge von 4,5mM Au kationisches Gold-Nanostäbchen in PBS in jede Petrischale, um eine Endkonzentration von 100 uM Au zu erreichen. Lassen Sie die Petrischalen in einer Inkubationszeit von 24 Stunden. </li><li> Als nächstes beachten Sie die Zellen unter einem optischen Mikroskop ihre guten Bedingungen und mit dem Hochladen zu bestätigen. Die Zellen sollten ihre normale Morphologie und eine Reihe von dunklen intrazellulären Vesikeln aufweisen. Lösen sich die Zellen durch einen Abstreifer, fusionieren die aus zwei Petrischalen, um eine geeignete Menge an Zellen für die folgenden Stufen (mindestens 2 x 10 6 Zellen) zu erreichen, und zentrifugieren (120 · g, 6 min) zu eliminieren jede Überschuss von kationischen Gold-Nanostäbchen. Die zelluläre Pellet sollte fast schwarz aussehen. </li><li> Suspendiere das Pellet in 2 ml PBS und die Zellen durch die Verwendung eines Bürker Kammer zählen. Zentrifuge eine Suspension , die 2 x 10 6 Zellen (120 · g, 6 min) und fixieren ihre Pellet in 2 ml 3,6% (w / v) Formaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Schließlich waschen dieses Pellets dreimal durch centrifugation (120 · g, 6 min), um das Fixierungsmittel zu entfernen. Verwenden PBS als Waschlösung. </li></ol></li></ol> 3. Embedment von Makrophagen in Chitosanfilme Hinweis: Die besonderen Eigenschaften von Chitosan 26, 27, 28, 29 genutzt biomimetische Phantome Makrophagen gefärbt mit kationischen Gold - Nanostäbchen herzustellen enthält. In Bezug auf andere Hydrogele, wie Agarose, Chitosan ermöglicht Filme , die viel stärker und dünner sind, die für PA 6 Mikroskopie kritisch ist. Die Herstellung dieser Phantome erfolgt nach bisherigen Protokolle 29, 30, 31 mit einigen Modifikationen wie 30 in den Anhänger vorgeschrieben. <ol><li> Bereiten Sie eine angesäuert (pH 4,5, durch Zugabe von Essigsäure) und viskosen 3% (w / v) mit niedrigem Molekulargewicht Chitosan (durchschnittliche MW 120 kDa) Lösung, es gründlich mischen undließ es bei 40 ° C für 24 h zu homogenisieren. </li><li> Enthaltend murine Makrophagen kationische Gold - Nanostäbchen (2 × 10 6 Zellen) mit 500 ul Chitosan - Lösung Als nächstes mischen. </li><li> Um ~ 50 &amp; mgr; m dicke Phantome zu erhalten, gießen Sie 250 mg der Mischung in 1,91 cm 2 Polystyrol - Formen und lassen sie unter einem Stickstoffstrom für 24 Stunden. Danach behandeln diese Proben mit 500 ul 1 M NaOH, um Vernetzung zu induzieren, und spülen Sie sie mit 10 ml Reinstwasser. </li></ol> 4. Testen der Stabilität von Photoakustische Conversion Anmerkung: Die Stabilität der PA-Umwandlung wird mittels PA Experimente mit dem hausgemachten Einrichtung untersucht, die in Lit. 6 beschrieben. <ol><li> Suspend ein Chitosanfilm die Makrophagen in DI-Wasser, beispielsweise durch die Verwendung eines Kunststoffhalter eingetaucht in eine Petrischale enthält, um einen Abstand von ca. 5 mm von der Unterseite der Platte zu halten. Setzen Sie diese Platte auf eine mikrometrischer XY-Tischum die Probenposition zu steuern. </li><li> Konzentrieren eines Laserstrahls mit ~ 5 nsec Impulsdauer in Resonanz mit der Längs plasmonic Band der Gold - Nanostäbchen (beispielsweise von einem optischen parametrischen Oszillator , der durch die dritte Harmonische eines Q-geschalteten gepumpten Nd: YAG - Laser mit Wellenlängenbereich von 400 - 2.500 Dauer von 5 nsec nm und Puls), die senkrecht zu der Filmoberfläche mit einem ~ 300 &amp; mgr; m Punktdurchmesser. <ol><li> Platzieren ein Dämpfungsglied vor dem Laseraustritt zum Abstimmen des Laserfluenz und mit einem Strahlteiler einen Teil des Laserstrahls auf einen Energiezähler (beispielsweise ein pyroelektrischer Detektor) und zu überwachen Fluenz Schwankungen zu fokussieren. Pflegen Sie die optische Fluenz unter ~ 1 mJ / cm 2 pro Impuls bei der Ausrichtung. Verwenden Sie geeignete Laserschutzbrillen, wenn der Laser eingeschaltet ist. </li></ol></li><li> Dip einen Ultraschallwandler (Frequenzbereich von 1 - 20 MHz) in die Petrischale ~ 2 mm aus der Folienoberfläche und stellen seine Position durch mikrometrischer Übersetzungen unter Verwendung vonund Rotationsstufen der PA-Signal von dem Film emittiert wird, zu maximieren. </li><li> Bestimmen Sie eine Sonde Fluence F LO, der nicht die Probe 6 nicht beschädigt: <ol><li> Bestrahlen einen beliebigen Punkt der Probe bei einer Fluenz etwa 1 mJ / cm 2 pro Puls mindestens 500 Impulse für. Für jeden Impuls, um das entsprechende PA-Signal von dem Ultraschallwandler und Laserflußdichte vom Energiezähler mit einem Oszilloskop zu erwerben. Benennen Sie die durchschnittliche Fluence als F LO - Studie. </li><li> Berechnen der Intensität des PA-Signal als seine Peak-zu-Peak-Amplitude als Funktion der Impulszahl. Um die Laserintensitätsschwankungen auf das Gegengewicht, normalisieren die Amplitude jedes PA - Signal auf das Verhältnis von seiner eigenen Einfluss auf F LO - Studie. Analysieren Sie den Trend der normierten PA Intensität als Funktion der Pulszahl und die Prüfung seiner Stabilität im Laufe der Zeit. </li><li> Im Falle der Instabilität, wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 mit einem niedrigeren Wert von F LO zu 4.4.3 <sup&gt; Studie. Im Falle der Stabilität, wiederholen sie mit einem Wert von F LO Studie höher ~ 10%, bis ein Verlust der Stabilität ergibt. Stellen Sie die Sonde Fluence F LO als der zweithöchsten Wert von F LO - Studie , die Stabilität gewährleistet. </li></ol></li><li> Messen Sie eine Umformung Schwellfluenz: <ol><li> Wählen Sie einen anderen beliebigen Punkt der Probe und der Sonde eine durchschnittliche PA Intensität (I LO a) über 500 Pulse bei F LO. </li><li> Stellen Sie eine nominale Fluence größer ist als F LO und 50 Impulse liefern. Nennen Sie ihre durchschnittliche Fluence als F exc. </li><li> Sonde , die eine durchschnittliche PA Intensität (I LO b) über 500 Pulse bei F LO erneut. Berechnen Sie das Verhältnis R = I LO b / I LO ein. Ein Wert von R unter Eins gibt Beweise für eine irreversible Änderung der optischen Eigenschaften der Probe. </li><li> Verwenden Sie die mikrometrischer XY-Tisch, um den Film zu bewegen und die poin ändernt der Probe nach dem Zufallsprinzip. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.1 mit unterschiedlichen Werten von F exc bis 4.5.4, um einige Werte von R unten zu nehmen, um und über die Einheit. 15 Punkte sind angemessen. </li><li> Plot R als Funktion von F exc und identifizieren die Umformungs Schwellfluenz F th als dieser Wert , wenn R von einem über statistische Unsicherheit zu unterscheiden beginnt. 6 </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Der Begriff tumorassoziiertes Makrophagen zeichnet sich als ein leistungsfähiges Konzept zu zielen 34 Krebs zu bekämpfen, 35, 36. Hier kann anstelle ihrer Zerstörung sind diese Zellen als zelluläre Fahrzeuge rekrutiert Gold-Nanostäbchen in einen Tumor zu bringen, durch die Ausnutzung ihrer Tropismus. Diese Perspektive erfordert eine durchdachte Design der Partikel, deren Integration in die Zellen und deren Charakterisierung. Wir haben festgestellt, daß die Pho...

Im Laufe der letzten zehn Jahre verschiedene plasmonic Partikel wie Gold - Nanostäbchen, Nanokugeln und Nanokäfige haben beträchtliche Aufmerksamkeit für Anwendungen in der biomedizinischen Optik 1, 2, 3, 4 empfangen. Abweichend von Standard - Gold - Nanokugeln, schwingen diese neueren Teilchen im nahen Infrarot (NIR) , welches 1 für tiefste optische Durchdringung durch den Körper und höchste optische Kontrast über endogene Komponenten. Dieses Merkmal hat das Interesse für innovative Anwendungen geweckt, wie der photoakustischen (PA) Bildgebung und die fotothermische Ablation von Krebs. Allerdings hemmen einige Probleme, die klinische Eindringen dieser Teilchen. Zum Beispiel neigt die optische Aktivierung ihre Überhitzung zu induzieren und ihre funktionelle Form zu mehr sphärischer Profile zu ändern, die eine Photoinstabilität 5 antreibt, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Ein weiteres Problem, das die wissenschaftliche Debatte dominiert, ist ihre systemische Zufuhr in Tumoren. Insbesondere Gold-Nanostäbchen kombinieren Größen, die zu pervade Tumoren sind ideal, die mit spezifischen Sonden von malignen Markern erhöhte Permeabilität und Retention und Leichtigkeit der Konjugation anzuzeigen. Daher ihre Vorbereitung für eine direkte Injektion in den Blutkreislauf wird als machbar Schema 10 wahrgenommen, 11, 12, 13. Jedoch bleibt dieser Weg problematisch, wobei die meisten der Partikel durch die mononukleären Phagozyten System 10 erfasst immer, 11, 12. Darüber hinaus ist ein weiteres Anliegen der optische und biochemische Stabilität der Partikel nach der Zirkulation durch den Körper 14. Wenn Teilchen ihre kolloidale Stabilität und Aggregat verlieren, ihre plasmonic Merkmale und Wärmeübertragungsdynamik von Plasmonen Kopplung leiden 15, </sbis&gt; 16, 17 und Quer Überhitzung 18. In jüngerer Zeit hat der Begriff den Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen auszunutzen als intelligente Alternative 19, 20, 21 entstanden. Diese Zellen halten eine angeborene Fähigkeit, zu erkennen und zu durchdringen Tumoren mit hoher Spezifität. Daher kann eine Perspektive , diese Zellen von einem Patienten zu isolieren sein, sie mit Gold - Nanostäbchen in vitro laden und sie dann in den Patienten zu injizieren zurück, mit der Absicht , sie als zelluläre Fahrzeuge verantwortlich für die Lieferung zu verwenden. Ein weiterer Vorteil wäre, um mehr Kontrolle über die optische und biochemische Stabilität der Partikel zu gewinnen, weil ihre biologische Schnittstelle würde in vitro konstruiert werden. Dennoch müssen die Leistungen dieser zellulären Fahrzeuge als optische Kontrastmittel eine kritische Analyse. In dieser Arbeit beschreiben wir die Vorbereitung und die wichtigsten Fragen von Cellular Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält. PEGylierte Gold - Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen 22, modifiziert , um ein kationisches Profil zu erreichen, die ihre Wechselwirkungen erwartet wird , mit plasmatischen Membranen 23, 24 zu fördern. Diese Partikel gehen effiziente und unspezifische Aufnahme von den meisten Zellarten, hoffentlich ohne viel mit ihren biologischen Funktionen zu stören. Murine Makrophagen geladen werden mit bis zu mehr als 200, 000 kationische Gold-Nanostäbchen pro Zelle, die in engen endocytic Vesikel eingeschlossen sein. Diese Konfiguration sollte Sorge entstehen, wegen der Gefahr von Plasmonen Kupplung und Quer Überhitzung im Inneren dieser Vesikel. Daher werden die Makrophagen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, das biologische Gewebe zu imitieren, um zu verifizieren, dass der größte Teil der Stabilität der PA-Umwandlung der Teilchen in der Übertragung aus dem Wachstumsmedium zu den endozytischen Vesikel zurückgehalten wird. effective Messkriterien sind, um die Stabilität der PA-Umwandlung unter Bedingungen von unmittelbarem Interesse für PA-Bildgebung zu messen, ausgearbeitet. Eine Umformung Schwelle in den Anfängen der optischen Instabilität nach einem Zug von 50 Laserpulse mit der typischen Wiederholungsrate von 10 Hz eingestellt. Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse Impulse für die Entwicklung neuer Strategien zur Verfügung stellen können Plasmonen Partikel zu Tumoren zu liefern.

<table><tbody><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>To synthesize gold nanoseeds</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>To PEGylate gold nanorods</td></tr><tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>To solubilize (11-mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>To centrifuge PEGylated gold nanorods</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Monocyte/macrophage murine cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Cell culture dish</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>To detach cells</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>To fix cells</td></tr><tr><td>Chitosan, low molecular weight</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td></tr><tr><td>Polystyrene cell culture plates</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td></tr><tr><td>Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Source of optical excitation for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pyroelectric detector&amp;nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pre amplified needle hydrophone</td><td>Precision Acoustic, Dorset, UK</td><td>Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td><td>To measure photoacoustic signals</td></tr></tbody></table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

Gold-Nanostäbchen sind attraktiv für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen, wie zum Beispiel die fotothermische Ablation und der photoakustischen Bildgebung von Krebs, dank ihrer intensiven optischen Absorption im nahen Infrarot-Fenster, niedrige Zytotoxizität und Potential zu Hause in Tumoren. Allerdings ist ihre Lieferung an Tumoren immer noch ein Problem. Ein innovativer Ansatz besteht aus der Ausbeutung des Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen , die mit Gold - Nanostäbchen in vitro geladen werden kann. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und die photo-akustischen Prüfung von Zellfahrzeuge Gold-Nanostäbchen enthält. PEGylierte Gold-Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen modifiziert, um eine kationische Profil zu erreichen. Bei Kontakt mit murine Makrophagen in gewöhnlichen Petrischalen werden diese Partikel gefunden massiven Aufnahme in endozytischen Vesikeln zu unterziehen. Dann werden diese Zellen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, die verwendet werden, um zu überprüfen, dass die Stabilität der photoakustischen Umwandlungsder Partikel wird in ihre Aufnahme in zelluläre Fahrzeugen beibehalten. Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse neue Inspiration für die Entwicklung neuer Strategien plasmonic Partikel zu Tumoren zu liefern liefern.

Hier wird die Machbarkeit der zellulären Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält, wird zusammen gezeigt mit typischen Ergebnisse des Protokolls. Die TEM - Aufnahmen in Abbildung 1 zeigen die übliche Erscheinung der Partikel nach dem Schritt 1 und ihre zellulären Fahrzeuge nach Schritt 2. Die Herstellung der Partikel und der Zellen für TEM - Aufnahmen wird an anderer Stelle <s...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods at JoVE.com

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

preparation-photoacoustic-analysis-cellular-vehicles-containing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Aufrufe.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Serie: Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Forschung

Biotechnik

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

Eine einfache Methode für die Größe kontrollierte Synthese von stabilen Oligomere Cluster von Goldclustern unter Umgebungsbedingungen

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Chemie

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

Hydrochinon-basierte Synthese von Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Construction and Operation of a Light-driven Gold Nanorod Rotary Motor System

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and artificial nanomotors and may provide new routes towards single cell analysis, studies of non-equilibrium thermodynamics, and mechanical actuation of nanoscale systems. A facile way to drive rotation is to use focused circularly polarized laser light in optical tweezers. Using this approach, metallic nanoparticles can be operated as highly efficient scattering-driven rotary motors spinning at unprecedented rotation frequencies in water.
In this protocol, we outline the construction and operation of circularly-polarized optical tweezers for nanoparticle rotation and describe the instrumentation needed for recording the Brownian dynamics and Rayleigh scattering of the trapped particle. The rotational motion and the scattering spectra provides independent information on the properties of the nanoparticle and its immediate environment. The experimental platform has proven useful as a nanoscopic gauge of viscosity and local temperature, for tracking morphological changes of nanorods and molecular coatings, and as a transducer and probe of photothermal and thermodynamic processes.

Plasmonic gold nanorods can be trapped in liquids and rotated at kHz frequencies using circularly-polarized optical tweezers. Introducing tools for Brownian dynamics analysis and light scatteringspectroscopy leads to a powerful system for research and application in numerous fields of science.

Bau und Betrieb eines lichtgetriebenen Gold Nanorod Rotary Motor Systems

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and ...

Ingenieurwesen

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Biochemie

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Neurowissenschaften

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Synthese von Nahinfrarot emittierenden Gold-Nanoclustern für biologische Anwendungen

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Direkte Synthese von Goldnanopartikeln für die Proteinlokalisierungsanalyse

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various physiological or pathological processes in all living organisms. Therefore, the development of clonable tags that can be used as electron microscopy probes is of great value, just as fluorescent proteins have played a crucial role in the field of optical imaging. The autonucleation suppression mechanism (ANSM) was recently uncovered, which allows for the specific synthesis of gold nanoparticles (AuNPs) on cysteine-rich tags, such as metallothionein (MT) and antifreeze protein (AFP).
Based on the ANSM, an electron microscopy labeling technology was developed, which enables the specific detection of tagged proteins in prokaryotic and eukaryotic cells with an unprecedented labeling efficiency. This study illustrates a protocol for the detection of MTn (an engineered MT variant lacking aldehyde-reactive residues) fusion proteins in mammalian cells with well-preserved ultrastructure. In this protocol, high-pressure freezing and freeze-substitution fixation were performed using non-aldehyde fixatives (such as tannic acid, uranyl acetate) to preserve near-native ultrastructure and avoid damage to the tag activity caused by aldehyde crosslinking.
A simple one-step rehydration was used prior to the ANSM-based AuNP synthesis. The results showed that the tagged proteins targeted various organelles, including the membranes and the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and mitochondrial matrices were detected with high efficiency and specificity. This research provides biologists with a robust protocol to address an enormous range of biological questions at the single-molecule level in cellular ultrastructural contexts.

Autor im Rampenlicht: Direkte Synthese von EM-sichtbaren Goldnanopartikeln in Zellen für die Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur  

The present protocol describes a clonable electron microscopy labeling technology for detecting metallothionein-tagged proteins in cells using a novel autonucleation suppression mechanism-based gold nanoparticle synthesis technique.