Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Regione Toscana e da Comunidade Europeia no quadro da bolha ERANET + Projetos LUS e BI-TRE.

Nota: Todas as concentrações de ouro nanorods são expressos em termos de Au molaridades nominais. Para efeito de comparação com outras obras, note que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 um nanobastões de ouro, no nosso caso. 1. Preparação de Cationic ouro nanobastões Nota: O método começa com a síntese de brometo de cetrimónio (CTAB) nanorods ouro -capped por a redução autocatalítico de HAuCl 4 com ácido ascórbico, de acordo com o protocolo apresentado por Nikoobakht et al 25 e adaptado de acordo com Ratto et al 26... Em seguida, esses nanobastões de ouro são modificados, a fim de ganhar mais biocompatibilidade e afinidade para membranas plasmáticas, pela combinação de polietilenoglicol vertentes 10, 11, 27, 28 e compostos de amônio quaternário 22. <ol><li> Purificar 24 ml CTAB-tampado nanobastões de ouro em um ConcentraçãN de 450 uM Au por dois ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Certifique-se de que a razão entre o volume morto para o volume inicial é de cerca de 1/200 ou inferior para todos os passos de centrifugação neste protocolo. Use CTAB 500 uM aquoso tal como uma solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em tampão de acetato de 6 ml de 100 mM a pH 5, contendo 500 uM de CTAB e 0,005% (v / v) de polissorbato 20. </li><li> Adicionar 30 ul de 10 mM de solução aquosa de alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etilenoglicol) (PM ~ 5000) e deixar a reagir durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 30 ul de 100 mM de (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N-brometo de trimetilamónio em sulfóxido de dimetilo e deixar em repouso durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Em seguida, adicionar 18 mL de 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água e purifica-se estas partículas por quatro ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Use 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água como solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em 2,4 ml de PBS estéril, a pH7.4. A concentração nominal final do ouro é de 4,5 mm. </li></ol> 2. Carregamento de Murino macrófagos com ouro nanobastões <ol><li> Utilizar a linha de células de monócitos / macrofágica J774A.1 e DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina como meio de cultura. Placa de 5 x 10 5 células em quatro placas de Petri de 60 mm de diâmetro e permitir-lhes crescer durante 24 h, de modo a ser subconfluentes no momento de desprendimento (ver passo 2.2). <ol><li> Durante todo o protocolo, manter as células em condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO2, 95% de ar e 100% de humidade relativa). Use uma câmara de fluxo laminar e equipamentos de proteção pessoal adequado para manipular as células. </li></ol></li><li> Após 24 h, carregar as células com nanobastões de ouro catiônicos e prepará-los para ser incorporado em filmes de quitosana: <ol><li> A fim de permitir que as partículas a ser absorvido pelas células, adiciona-se uma alíquota de 4,5Au mM nanorods ouro catiónico em PBS em cada caixa de Petri, de modo a atingir uma concentração final de 100 uM de Au. Deixar os pratos de Petri em incubação durante 24 horas. </li><li> Em seguida, observe as células sob um microscópio óptico para confirmar as suas boas condições eo upload. As células devem exibir a sua morfologia normal e um número de vesículas intracelulares escuras. Separe as células por um raspador, fundir os de duas placas de Petri, a fim de alcançar uma quantidade adequada de células para os seguintes passos (pelo menos 2 x 10 6 células), e centrifuga-se-lhes (120 xg, 6 min) para eliminar quaisquer excesso de ouro nanorods catiónicos. O pellet celular deve olhar quase preto. </li><li> Suspende-se o sedimento em 2 ml de PBS e contar as células pela utilização de uma câmara de Burker. Centrifugar a suspensão contendo 2 x 10 6 células (120 x g, 6 min) e fixar sua sedimento em 2 ml de 3,6% (w / v) de formaldeído em PBS, durante dez minutos à temperatura ambiente. Finalmente, lavar este sedimento três vezes por centrifugatde iões (120 xg, 6 min), a fim de remover o fixador. Use PBS como solução de lavagem. </li></ol></li></ol> 3. incrustação de macrófagos em Películas de quitosano Nota: As propriedades peculiares de quitosana 26, 27, 28, 29 são exploradas para produzir fantasmas biomiméticos que contêm macrófagos corados com nanobastões de ouro catiônicos. No que diz respeito a outros hidrogeles, tais como agarose, quitosano permite filmes que são muito mais forte e mais fino, que é crítico para microscopia PA 6. A fabricação desses fantasmas é realizada de acordo com protocolos anteriores 29, 30, 31, com algumas modificações, conforme prescrito no os seguintes 30. <ol><li> Prepara-se uma acidificada (pH 4,5, obtidos por adição de ácido acético) e viscoso 3% (w / v) de quitosano de baixo peso molecular (PM médio de 120 kDa) solução, misturá-lo completamente edeixá-lo homogeneizar durante 24 h a 40 ° C. </li><li> Em seguida, misturar macrófagos de murino contendo ouro nanorods catiónico (2 X 10 6 células) com 500 ul de solução de quitosano. </li><li> De modo a obter ~ 50 um de espessura fantasmas, despeje 250 mg da mistura em moldes de 1,91 cm 2 de poliestireno e deixá-los sob uma corrente de azoto durante 24 h. Posteriormente, o tratamento destas amostras com 500 uL de NaOH 1 M, de modo a induzir a reticulação, e lavá-los com 10 ml de água ultrapura. </li></ol> 4. Teste de Estabilidade Conversão de Fotoacústica Nota: A estabilidade da conversão PA é investigada por meio de experimentos PA com a instalação de fabricação caseira que é descrito na ref 6. <ol><li> Suspender um filme de quitosano contendo os macrófagos em água desionizada, por exemplo, pelo uso de um suporte de plástico imersas em uma placa de Petri, de modo a manter uma distância de aproximadamente 5 mm da parte inferior da placa. Coloque esta placa em um estágio XY micrométricaa fim de controlar a posição da amostra. </li><li> Concentre-se um feixe de laser com ~ 5 duração nseg pulso em ressonância com a banda plasmónico longitudinal dos nanorods ouro (por exemplo, a partir de um oscilador paramétrico óptico bombeado pela terceira harmónica de um laser de Nd comutação-Q: YAG com o comprimento de onda de 400 - 2500 nm e duração de impulso de 5 ns) perpendicular à superfície da película com um diâmetro do ponto ~ 300 uM. <ol><li> Coloque um atenuador em frente da saída do laser para ajustar a fluência do laser e utilizar um divisor de feixe para incidir parte do feixe de laser a um medidor de energia (por exemplo, um detector piroeléctrico) e monitorizar as flutuações de fluência. Manter a fluência óptica abaixo de ~ 1 mJ / cm2, por impulso durante o alinhamento. Utilize óculos de segurança a laser adequada sempre que o laser é ligado. </li></ol></li><li> Mergulhar um transdutor de ultra-sons (gama de frequência de 1 - 20 MHz) para a placa de Petri ~ 2 milímetros fora da superfície da película e ajustar a sua posição utilizando as traduções micrométricase fases de rotação para maximizar o sinal PA emitida a partir do filme. </li><li> Determinar uma fluência sonda F LO que não danificar a amostra 6: <ol><li> Irradiar um ponto aleatório da amostra a uma fluência de cerca de 1 mJ / cm2, por impulso de pelo menos 500 pulsos. Para cada pulso, PA adquirir o sinal correspondente a partir do transdutor de ultra-sons e de fluência laser a partir do medidor de energia com um osciloscópio. Nomeie a fluência médio como teste F LO. </li><li> Calcular a intensidade do sinal de PA como a sua amplitude de pico-a-pico em função do número de impulsos. A fim de contrabalançar as flutuações de intensidade de laser, normalizar a amplitude de cada sinal de PA para o rácio do seu próprio fluência a julgamento F LO. Analisar a tendência de a intensidade normalizada PA como uma função do número de impulsos e verificar a sua estabilidade ao longo do tempo. </li><li> No caso de instabilidade, repita os passos 4.4.1 a 4.4.3 com um valor menor de F LO <sup&gt; julgamento. No caso de estabilidade, repeti-los com um valor de ensaio F LO superior em ~ 10%, até uma perda de estabilidade surge. Defina a sonda fluência F LO como o segundo valor mais alto de julgamento F LO, que garante estabilidade. </li></ol></li><li> Meça uma fluência limiar reformulação: <ol><li> Escolha outro ponto aleatório da amostra e sondar uma intensidade PA média (I LO a) mais de 500 pulsos a F LO. </li><li> Definir uma fluência nominal superior a F LO e entregar 50 pulsos. Nome sua influência média, como F exc. </li><li> Sondar uma intensidade média PA (I LO b) mais de 500 pulsos a F LO mais uma vez. Calcular a relação R = I LO b / I LO a. Um valor de R abaixo da unidade dá provas de uma alteração irreversível das propriedades ópticas da amostra. </li><li> Utilizar a plataforma XY micrométrico para mover o filme e alterar o poinT da amostra ao acaso. Repita os passos 4.5.1 a 4.5.4 com diferentes valores de F iva, de modo a levar alguns valores de R abaixo, em torno e acima da unidade. 15 pontos são razoáveis. </li><li> Lote R como função de F exc e identificar o limite de fluência F remodelação th como valor que quando R começa a variar de um para além incerteza estatística. 6 </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A noção alvejar macrófagos associados a tumores está a emergir como um conceito poderoso para combater o câncer 34, 35, 36. Aqui, em vez de sua destruição, essas células são recrutados como veículos celulares para trazer nanobastões de ouro em um tumor, pela exploração do seu tropismo. Esta perspectiva requer um design inteligente das partículas, a sua integração nas células e sua caracterização. Verificou-se que a fotoestabilidade de macrófagos ...

Durante a última década, várias partículas plasmonic como nanobastões de ouro, nanoshells e nanocages, têm recebido uma atenção considerável para aplicações em óptica biomédica 1, 2, 3, 4. Em desacordo com nanoesferas de ouro padrão, estas partículas mais recentes ressoam na janela do infravermelho próximo (NIR), que prevê mais profunda penetração óptica através do corpo e maior contraste óptico mais componentes endógenos 1. Este recurso tem despertado interesse para aplicações inovadoras, tais como a fotoacústica (PA) de imagem e a ablação fototérmica de câncer. No entanto, vários problemas restringir a penetração clínica destas partículas. Por exemplo, a sua activação óptico tende a induzir o seu sobreaquecimento e modificar suas formas funcionais para com perfis mais esféricas, que dirige um photoinstability 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Outra questão que domina o debate científico é a sua entrega sistémica em tumores. Em particular, nanobastões de ouro combinam tamanhos que são ideais para permear tumores que exibem permeabilidade aumentada e retenção e facilidade de conjugação com sondas específicas de marcadores malignas. Portanto, a sua preparação para uma injecção directa na corrente sanguínea é percebida como um sistema viável 10, 11, 12, 13. No entanto, este procedimento continua a ser problemática, com a maioria das partículas tornar-se capturado pelo sistema de fagócitos mononucleares 10, 11, 12. Além disso, outra preocupação é a estabilidade óptica e bioquímica das partículas após a circulação através do corpo 14. Quando as partículas perdem sua estabilidade coloidal e agregados, as suas características plasmonic e dinâmicas de transferência de calor pode sofrer de acoplamento plasmonic 15, </s-se&gt; 16, 17 e cross-superaquecimento 18. Mais recentemente, a noção de explorar o tropismo de macrófagos associados a tumores emergiu como uma alternativa inteligente 19, 20, 21. Estas células manter uma capacidade inata para detectar e permeiam tumores com alta especificidade. Portanto, uma das perspectivas pode ser a de isolar essas células de um paciente, carregá-los com nanobastões de ouro in vitro e depois injetá-las de volta para o paciente, com a intenção de usá-los como veículos celulares responsáveis ​​pela entrega. Outra vantagem seria a ganhar mais controle sobre a estabilidade óptica e bioquímica das partículas, por causa de sua interface biológica seria construída in vitro. Ainda assim, os desempenhos destes veículos celulares como agentes de contraste óptico precisa de uma análise crítica. Neste trabalho, nós descrevemos a preparação e questões críticas de Cellulveículos AR contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer. Nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos de amónio quaternário 22, a fim de obter um perfil de catiónico que é esperado para promover as suas interacções com membranas plasmáticas 23, 24. Estas partículas passam por absorção eficiente e inespecífica da maioria dos tipos celulares, esperançosamente sem interferir muito com as suas funções biológicas. macrófagos murinos são carregados com até um máximo de 200, 000 nanobastões de ouro catiônicos por célula, que se tornam situam no interior de vesículas de endocitose apertados. Esta configuração deve surgir preocupação, por causa da ameaça de acoplamento plasmonic e cross-sobreaquecimento dentro destas vesículas. Portanto, os macrófagos são incorporados em hidrogéis biopolimêricos que imitam tecidos biológicos, a fim de verificar que a maior parte da estabilidade do PA conversão das partículas é retido na transferência do meio de crescimento para as vesículas endocíticas. effectivcritérios de medição e são trabalhados, a fim de medir a estabilidade da conversão PA em condições de interesse imediato para a imagem latente PA. Um limiar remodelar está configurado bem no início da instabilidade óptica após um trem de 50 pulsos de laser com a taxa de repetição típico de 10 Hz. Estamos confiantes de que estes resultados podem dar um impulso para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

nanorods ouro são atraentes para uma variedade de aplicações biomédicas, tais como a ablação fototérmico e a imagiologia de cancro fotoacústica, graças à sua intensa absorvância óptica na janela de infravermelho próximo, de baixa toxicidade e potencial de repouso em tumores. No entanto, a sua entrega aos tumores continua a ser um problema. Uma abordagem inovadora consiste no aproveitamento do tropismo de macrófagos associados a tumores que podem ser carregados com ouro nanorods in vitro. Aqui, descrevemos a preparação ea inspeção fotoacústica de veículos celulares contendo nanobastões de ouro. nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos quaternários de amónio, a fim de alcançar um perfil catiónico. Em contacto com macrófagos murinos em pratos de Petri normais, estas partículas encontram-se submeter a absorção maciça em vesículas endocíticas. Em seguida, estas células são incorporadas em hidrogéis biopolimêricos, que são usadas para verificar que a estabilidade da conversão fotoacústicadas partículas é retido na sua inclusão em veículos celulares. Estamos confiantes de que estes resultados podem fornecer uma nova inspiração para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

Aqui, a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer é mostrado juntamente com resultados típicos de protocolo. As imagens por MET da Figura 1 mostram o aspecto habitual das partículas após o passo 1 e os seus veículos celulares após o passo 2. A preparação das partículas e das células para imagiologia MET é descrita na literatura 17.</...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K visualizações.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Bioengenharia

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabricação de Micro-tecidos utilizando Módulos de Colágeno Gel células contendo

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Oftalmoscopia Fotoacústica integrada e Spectral-domínio Tomografia de Coerência Óptica

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Cistografia fotoacústica

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Elaboração e análise de<em&gt; In Vitro</em&gt; Três mama Dimensional Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabricação e caracterização de espectros ópticos de tecido contendo Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...