This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

倫理声明：動物を対象とする手順は、欧州条約123 /欧州評議会と指令609分の86 / EECに一致バリャドリッド大学動物飼育施設によって承認されたプロトコルの下で処理されました。 ラット海馬ニューロンの1短期・長期の文化<ol><li>ポリ-D-リジンの製造は、12 mmのガラスカバースリップコーティング。 <ol><li>少なくとも24時間、エタノール中に直径12mmのガラスカバースリップを滅菌します。彼らは無菌条件下で乾燥することができます。 </li><li>ペトリ皿にパラフィルムのストリップ上にカバーグラスを配布します。 1 mg / mlのポリ-D-リジンの200μlで、各カバーグラスの表面を覆います。 O / Nを処理できるようにします。 </li><li>次の日は、無菌条件下で90分間蒸留滅菌水で15分毎にカバーガラスを洗います。 </li><li>神経基礎培養培地500μlで4ウェルmultidishプレートを埋めるウェルあたり。神経基礎培養培地を補足する必要があります10％ウシ胎児血清、2％のB27、を1μg/ mlのゲンタマイシンおよび2mM L-グルタミン。 </li><li> multidishプレートにカバースリップを置きます。加湿37ºC、使用するまで、5％CO 2インキュベーターでそれらを維持します。 </li></ol></li><li>新生ラットからの海馬神経細胞の単離。 <ol><li>無菌条件下でバイアル（20μL/ ml）に1.8ミリリットルパパイン溶液（直接購入）準備：20μlの最終濃度を得るために/ 1.8ミリリットルハンクスプラス0.6％BSA中で約40μlのパパイン追加ML（μlを計算する必要があります）サプライヤーの条件によって異なります。ハンクス0.6％のBSA、4％のウシ血清アルブミンの15 mlのHBSS培地85 mlと混合することにより調製される（BSA、100 mlのHBSS中でBSAを4g解決調製しました）。無菌フードでそれを準備します。 </li><li>使用前に37ºCで30分間ハンクスプラス0.6％BSA中のパパインをインキュベートします。使用前に0.22μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。 </li><li>ダルベッコ添加することによりハムF-12培地を調製二重滅菌蒸留水900ミリリットルにイーグル培地粉末（1Lあたり13.5グラム）を修正しました。その後、6グラムHEPESを追加して、336ミリグラムのNaHCO 3及びNaOH 4 N. 1 L溶液を得るために、滅菌水を加え、0.20μmのポリエーテルスルホン（PES）ボトルトップフィルターを使用してフィルタリング使用し7.42のpHを調節します。無菌フード内でこのプロセスを実行します。最後に、使用前に無菌条件下でのCO 2で溶液を飽和させます。ストアソリューション4ºCで、冷却それらを使用しています。 </li><li>断頭により新生児（P0）仔ラットを安楽死させると、滅菌HBS培地で頭を洗います。滅菌はさみの助けを借りて、頭蓋骨を開きます。へらで脳を抽出し、HamのF-12培地中ですぐにそれを洗います。 </li><li>各半球（ 図1B）でメスの助けを借りて斜めカットを行い、ハムF-12培地を含むペトリ皿にそれを運びます。 </li><li>解剖鉗子の助けを借りて、拡大鏡の下で慎重に髄膜を捨てます。 </li> &lt;李は&gt;虫眼鏡を使用して、皮質の上に特徴凹状の場所に海馬を特定します。そして、1国境から慎重に引き出し、目のはさみを使用して、その位置からそれを除去することによって、皮質から海馬を分離。 </li><li>無菌ハンクス培地のCa 2+を欠くとMg 2+プラス0.6％BSAで満たされた4ウェルプレートに海馬組織を移し、海馬組織を洗います。培地を除去せずに、同じ目のはさみを使用して、（2×2ミリメートル程度）小片に組織を切断します。 </li><li> 1.8ミリリットルプレフィルタパパイン溶液を含有するバイアルに海馬の部分を転送します。そして時折、穏やかに振とうしながら37ºCでそれらを培養します。 15分後、（最終50μg/ mlの）のDNase I溶液の90μlを添加し、さらに15分間インキュベートします。 </li><li> 10ミリリットルの遠心チューブに組織を移し、新たな神経基礎培養培地で断片を洗います。 5mLのプラスチックピップを通して組織フラグメントを通過させることにより、細胞懸濁液を得ますETTE。 </li><li> 5分間160×gで遠心細胞懸濁​​液。プラスチック滅菌パスツールピペットを用いて上清を除去したNeurobasal培養培地1mlのピペットを自動1mlで注意深くペレットを一時停止します。 </li><li>ノイバウアーカウントチャンバーを用いて細胞密度を測定します。ノイバウアー室の上にカバーガラスを置きます。 10μlの細胞懸濁液を追加します。細胞懸濁液を均一かつ気泡を作るんチャンバに入ることを確認してください。 30×10 3細胞を含有する40-80マイクロリットルの適切な低下を得るために、顕微鏡下で細胞数をカウントし、対応する計算を実行します。細胞の総数は、使用される動物の数に依存します。 </li></ol></li><li>短期およびラット海馬神経細胞の長期培養。 <ol><li>それぞれに、約50マイクロリットルの低下に約30×10 3細胞を神経基礎培養培地500μlを含む4ウェルmultidishプレートの上に前に準備し、インキュベーター、プレートに保持1つのウェルポリ-D-リジンでコーティングされた、直径12mmのガラスカバースリップを含むmultidishプレートの。 </li><li>文化を変えることなく、実験の前に、インビトロでの 2-5日（DIV、短期、若い文化）または&gt; 15 DIV（長期熟成の文化）加湿37ºC、5％CO 2インキュベーター内で一次海馬細胞を維持メディア。 </li></ol></li></ol>細胞質Ca 2+濃度の2蛍光イメージング<ol><li>蛍光イメージングのための試験溶液の調製。 <ol><li> NaCl 145、KClの5、のMgCl 2 1、CaCl 2を1、グルコース10、ナトリウムHEPES 10（pHは7.42を）：MMで、含む外部HEPES緩衝生理食塩水（HBS）溶液を調製します。 </li><li> NaCl 146、KClの5、グルコースのCaCl 2 1、10およびHEPES 10（pHは7.42）：MMで含む外部、Mg 2+を含まない、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）ソリューションを準備します。 </li><li> FINAでのMg 2+を含まない 、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）にNMDAを解きますリットル、100μMの濃度と10μMのグリシンとそれを補います。 </li><li> KCl 145、MgCl 2を1、CaCl 2を1、グルコース10およびHEPES 10（pHは7.42）を：（MMで）解くことで代わりのNaClのKClを含むHBS溶液を調製します。 </li></ol></li><li>蛍光カルシウムプローブFURA2 / AMで海馬細胞の負荷。 <ol><li>インキュベーターからカバーガラスを含む細胞培養物を取り、ウェルあたりHBSを500μlを含む新しい4ウェルmultidishプレートにそれらを転送することにより、室温でHBS培地でそれらを洗ってください。 </li><li> FURA2で細胞をインキュベート/暗所でRT（25ºC）で60分間（同じHBS培地中で調製した）AM 4μM。 </li><li> 60分後、新鮮なHBS培地でカバーグラスを洗います。 </li></ol></li><li>培養細胞中の[Ca 2+]細胞質ゾルの蛍光画像を記録します。 <ol><li>ランプ、顕微鏡、灌流システム、蛍光カメラとコンピュータの電源を入れます。 </li><li>以下のためのサーモスタットのプラットフォームでカバースリップを置き倒立顕微鏡のステージ上でオープン12ミリメートルのガラスカバースリップとは、対物レンズ40倍（1.3油、NA）を使用して微細なフィールドを選択します。不在または試験物質の存在下で（37ºC）予め温めたHBS培地で連続的に細胞を灌流。 /分、約5〜10 mlとの速度で流れを維持します。 注：生きている細胞の細胞灌流システムは、オープン12ミリメートルのガラスカバースリップ用サーモスタットプラットフォームに装着されています。弁制御装置を搭載した8ライン重力駆動灌流システムは、溶液を灌流するために使用されます。真空ポンプは、過剰の培地を除去する責任があります。ソリューションは、内管の加熱システムを使用して加熱されます。 </li><li>シャッターが両方の励起波長で閉鎖して、背景画像をキャプチャします。 </li><li> 340および380 nmで交互に細胞をエピは、点灯します。レコード光が520nmのフラ-2ダイクロイックミラーによってフィルタリングされた蛍光カメラ、と5-10秒で放出されます。 </li><li>記録期間が終了すると、完全な配列のOを格納Fの画像は、さらなる分析のためにコンピュータ520 nmで放出されました。 </li></ol></li><li>記録された蛍光画像の解析。 <ol><li>実験ファイルを開きます。 AQUACOSMOSソフトウェアを使用して、「比率」をクリックして、所望の比率の範囲を選択します。比率画像のシーケンスを取得するために、得られた画像内の画素比率によってピクセルを計算します。 </li><li> 「背景除去」を調整することにより、バックグラウンドを減算します。プレス「スタート計算」。 </li><li>プレス「常にシーケンス」ボタンおよび利息（ROIを）の古代の領域を消去します。個々の細胞の定量的分析のために、個々のニューロンに対応する興味やROIの新しい領域を確立します。各ROIと各画像に対応する各画素の平均全比の値は、個々のROI（セル）用の比率の蛍光値の記録を取得します。 </li><li>グラフのprogrに各ROIに対応する比率の蛍光値をエクスポート個々の録画をグラフ化するには午前。 </li><li>適切なデータ分析やグラフ作成ソフトウェアを使用して、各刺激に応答して蛍光比の上昇の大きさを推定するために、対応する計算を行います。 </li></ol></li></ol>ミトコンドリアのCa 2+濃度の3生物発光イメージング<ol><li> mitGAmutプラスミドと培養海馬神経細胞のトランスフェクション。 注：細胞は、まず、ミトコンドリア標的化配列および緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合した Ca 2+結合部位を欠く突然変異したエクオリンを含むmitGAmutプラスミドでトランスフェクトされています。この構造は、ミトコンドリアのCa 2+取り込みの大きな上昇を検出し、GFP蛍光によってトランスフェクトされた細胞の同定を可能にします。プラスミドが開発され、親切P.Brûletおよび共同研究者18（CNRS、パリ、フランス）から提供されました。 <ol><li>ウシ胎児血清を欠いている、神経基礎培養培地を含む、神経基本TFを準備し、B27、gentamicおよび2mM L-グルタミン。 </li><li>神経基礎TF50μlのプラスバイアル（溶液A）で2.5μlのトランスフェクション試薬を準備します。 50神経基本TFμlのプラス4μgのバイアル中mitGAmutプラスミド（溶液B）を用意します。振盪せず、20分の間に混合できるように溶液Aの上に静かにB液を追加します。 </li><li>新鮮な神経基礎TFの200μLを含む新しいmultidishプレートに海馬ニューロンを含むカバースリップを転送します。 </li><li>すべてのカバーガラスの上にドロップすることにより溶液A + B100μlのドロップを追加します。 30分間インキュベートします。メディアを削除します。新鮮な神経基本TFとの細胞1回洗浄。元の神経基礎培養培地にカバースリップを返します。 </li><li>効率的な発現およびプローブの標的を可能にするために、トランスフェクション後37ºC、5％CO 2でさらに24時間培養ニューロン。 </li></ol></li><li>生物発光イメージングのための試験溶液を調製します。 <ol><li> NMDA100μMのまたは145mMのKClを含むHBS溶液を調製します（ステップ2.1）上記。 10 mMのカルシウムを含む2+プラス100μMをジギトニンHBS溶液を調製します。 </li></ol></li><li>セレンテラジンnのミトコンドリアを標的とエクオリンの再構成。 <ol><li> HBSの200μLを含む4ウェルプレートにトランスフェクトされた海馬ニューロンを含むトランスファーカバースリップ。 </li><li> 4μMの最終濃度のために、HBSの200μlにセレンテラジン4μlのn個（200μm）を加え、穏やかに混合。 RT（25ºC）で2時間、暗所でインキュベートします。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの記録生物発光画像の[Ca 2+]。 <ol><li>顕微鏡、ランプ、灌流系、生物発光カメラとコンピュータの電源を入れます。 </li><li>サーモスタット（37ºC）灌流チャンバーに再構成カバースリップを転送し、5〜10ミリリットル/分の速度で予め温めHBS溶液で連続的に灌流。 </li><li>対物レンズ40倍（油、NA：1.3）を使用して、Aを発現する細胞を含む顕微鏡視野を選択FITCフィルターを用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現と関連した蛍光発光によって示されるようにpoaequorins。典型的なフィールドは、1-2トランスフェクトされた細胞を含有してもよいです。 CCDカメラを用いて、GFPの蛍光画像を取り込みます。 </li><li>顕微鏡光をオフにします。光の経路に位置するダイクロイック含有ボックスを削除します。励起光をオフにして、完全な暗闇のための暗ボックスを閉じます。 </li><li>とやテスト・ソリューションは、37ºCで事前に温めなしHBS培地5-10 ml /分で細胞を灌流。 </li><li>画像処理装置で処理光子計数カメラとフォトニック放出画像ごとに10秒をキャプチャします。 </li><li>各実験の最後に、残りのすべての光放射を放出するために、HBS中10mMでジギトニン0.1mMのCaCl 2で細胞を透過性。 注：これらのフォトニック排出量は総排出量のフォトニック、のCa 2+濃度の校正のために必要な値を推定するために加算されなければなりません&lt;。/ LI&gt; <li> GFP関連蛍光画像とコンピ​​ュータに保管して生物発光画像は、フォトンカウンティングイメージングの前に捕獲しました。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの[Ca 2+]を反映した生物発光画像の解析。 <ol><li>特定のソフトウェアを使用して、フォトニック排出量を定量化します。光子放出はBriniらによって記載されたアルゴリズムを使用して、ミトコンドリアの遊離Ca 2+濃度 （の[Ca 2+] MIT）に変換することができる。15。 </li><li>実験およびGFP蛍光画像を開きます。実験の開始時に取り込まれた蛍光画像に応じてトランスフェクトされた細胞の形状を描くことで、特定のソフトウェアの助けを借りて、興味（ROIを）の領域を選択します。 </li><li>すべての画像に同じのROIを貼り付けます。各ROIの総光子放出は、各時点で各セルの蛍光発光値（L）を得るために特定のソフトウェアを用いて計算されます。 </li><li>すべてのフォトニックemissを追加すべての光子放出を含む生物発光画像を得るために、特定のソフトウェアを使用して、透過性をジギトニン後に得られたものを含む生物発光画像中のイオン。 </li><li>計算のための特定のソフトウェアへの関心のあらゆる地域のためのフォトニック排出量の書き出し値。これを行うには、各時点でのすべてのROIのための生物発光値を計算するために、「グラフ」をクリックします。 「合計値」を選択し、「すべての画像に現在のROIを使用しています。押して、「計算します」。ワークシートに「txt.file &#39;とエクスポートデータを保存します。すべてのROIのために、の[Ca 2+] MITは、次のアルゴリズムを使用して計算されます。 [Ca 2+]（M）= [R +（R・K TR） - 1] / [K R - （R・K R）]; ここで、 R = [L /（L トータル λ）] 1 / N Lは、関心のある各領域の測定時に放出された発光です。 Lの合計があります各関心領域について測定時にその時点での組織中に存在する数を加えた後、残りのトータル発光。 λ、K TR、K Rおよびnは、値がエクオリン（野生型または変異）とcoelenterazin使用（野生型またはN型）だけでなく、記録温度16の組み合わせに依存する定数です。ここで使用される組み合わせについては37ºCで、（AEQとcoelenterzine nを変異させ）、我々は次の値を使用：K R = 8.47×10 7、K TR = 165.6×10 3を 、nは1204、λ= 0138 =。 </li></ol></li><li>適切なデータ分析を使用して、各刺激に応答して生物発光の上昇の大きさを推定し、ソフトウェアをグラフための対応する計算を行います。 </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

細胞内Ca 2+の改造老化脳内の恒常性は、認知喪失に関係しているが、虚血性損傷、興奮毒性および神経変性に対する感受性を増加させました。 in vitroでこの仮説を調べるために、のCa 2+イメージング手順が用意されています。残念ながら、古い海馬ニューロンの生存可能な培養物は、信頼性がありません。最近では、ROSの蓄積、リポフスチン顆粒の形成、ヘテロ病巣、pJ...

興奮毒性は、虚血などの神経学的傷害であり、例えば、アルツハイマー病の1などのいくつかの神経変性疾患における神経損傷および細胞死に寄与する最も重要な機構の1つです。神経毒性のこのタイプは、主にカルシウムに作用するグルタメートにより媒介される2+ -permeable、イオンチャネル型NMDA受容体（NMDAR）2。グルタミン酸への培養神経細胞の曝露は、神経細胞のアポトーシス4を引き起こす興奮毒性3、につながることができます。我々と他の人は、以前、NMDA誘導性アポトーシスに対するニューロンの脆弱性は、in vitroでの開発と5-8の加齢に変更される可能性があることを報告しています。 これは、広く細胞質ゾルのフリーCa 2+濃度（の[Ca 2+] CYT）の増加は、細胞の活性化につながることが認められています。この上昇は高すぎ、および/ ​​または十分に持続する場合には、それは細胞死9をトリガすることができます。また、提案されていますその興奮毒性は、ミトコンドリアのCa 2+取り込み10、グルタミン酸誘発細胞死11に対するミトコンドリア脱共役保護ニューロンとニューロンの治療以降が必要です。ミトコンドリアはあまりにも多くのCa 2+を取る場合は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口部は、シトクロムcおよび他のプロアポトーシス因子の放出、およびアポトーシスを誘導につながる、発生することがあります。私たちは最近、このミトコンドリアのCa 2+取り込みを直接直接単一海馬ニューロン5におけるNMDA誘発性のミトコンドリアのCa 2+取り込み、この記事で報告されているメソッドを測定することにより、興奮毒性の年齢依存性の感受性に関連していることが示されています。このような学習、記憶およびその他の認知プロセス12のような生理学的プロセスに関与する海馬は、加齢と神経変性疾患13に対して非常に脆弱です。これは、 インビトロで数週間後、ことが提案されている、培養海馬ニューロンは、高齢者のニューロン14の典型的な特徴の数を示します。したがって、長期培養海馬神経細胞は老化で強化された興奮毒性のの Ca 2+媒介メカニズムを調査するための包括的なモデルを提供することができます。 提示された方法の全体的な目的は、長期培養海馬ニューロンにおけるNMDA受容体アゴニストによって誘発される差動の Ca 2+応答を含む老化脳における細胞内Ca 2+ホメオスタシス又はCa 2+リモデリングの実質的な変化を調査することです。この方法は、それぞれ、ラット海馬ニューロンの培養物の詳細な説明及び個々のニューロンにおける蛍光および生物発光イメージングによる細胞質ゾルおよびミトコンドリアの Ca 2+濃度のモニタリングを含みます。培養神経細胞における細胞質ゾルのCa 2+の蛍光イメージングは、標準的な手順です。しかし、この方法は、サブのための信頼性が低いですミトコンドリアのCa 2+を含む細胞のCa 2+測定。この理由も、mMのレベルに低μMレベルからミトコンドリアで変更される可能性のCa 2+濃度のための合成プローブの適切な標的と不適切な親和性の欠如を含みます。インスタンスエクオリンのようなタンパク質に基づいたCa 2+プローブの使用は、細胞内小器官への標的化し、特定のCa 2+結合部位15を欠く異なるセレンテラジンまたは変異プローブを用いて、異なる誘導体のCa 2+親和性の使用を許可されています。このように、ミトコンドリア標的エクオリンを発現する細胞の生物発光イメージングは、個々の神経細胞におけるミトコンドリアの Ca 2+濃度のモニタリングを可能にすることができます。しかし、この手順では、生物発光イメージングのために16-18光子計数カメラや超CCDカメラの使用を必要とするかもしれません。この方法は、よりestablに確認すべきである小説の結果を得ることが脳の老化のモデルは古い動物から、例えば、脳スライス、としてished。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

神経変性および虚血に関連する神経細胞死に対する感受性は非常に高齢の脳で増加しているが、原因となるメカニズムはひどく知られています。興奮毒性、両方の傷害により誘発されるニューロン損傷に寄与すると考えプロセスは、 の Ca 2+流入およびミトコンドリアの Ca 2+過負荷を促進するグルタミン酸受容体の活性化によって媒介されます。 細胞内Ca 2+恒常性の細胞内Ca 2+ホメオスタシスや改造の実質的な変化は、古いニューロンにおけるニューロン損傷を好むことがあります。老化中のCa 2+リモデリングを調査するために、我々 は 、in vivoでの神経細胞を老化させ、いくつかの態様で似ているラット海馬神経細胞の長期培養でのライブセルイメージングを使用しています。このために、海馬の細胞は、最初の場所で、新鮮に生まれたばかりのラットの海馬から分散され、ポーリ-D-リジンコーティングされ、カバーガラス上にプレーティングしました。その後、培養物は数日または数ワットのために制御されるメディアに保管されていますそれぞれ、老若男女ニューロンを調査するためeeks。第二に、培養されたニューロンはFURA2にロードされ、デジタル蛍光比イメージングを使用して、細胞質ゾルCa 2+濃度の測定を行っています。第三に、培養神経細胞は、ミトコンドリアを標的とする低親和性エクオリンとGFPのタンデムを発現するプラスミドでトランスフェクトされます。 24時間後、細胞内でエクオリンはセレンテラジンを用いて再構成され、神経細胞は、ミトコンドリアのCa 2+濃度を監視するための生物発光イメージングに供します。この3段階の手順としては、例えば、細胞質ゾル、関連刺激に対するミトコンドリアのCa 2+応答のモニタリングを可能にするグルタミン酸受容体アゴニストNMDAこれら及び他の応答は、加齢によって影響を受けるかどうかを比較します。この手順では、どのように影響を与える細胞質とミトコンドリアのCa 2+選択刺激に対する応答だけでなく、神経細胞を防止することを目的とし選択される薬剤のエージング試験のように、新しい洞察をもたらすことができます加齢関連疾患で死亡。

ここでは、高齢者の神経細胞での[Ca 2+]のCa 2+改造および細胞質とミトコンドリアのNMDAの効果を評価するための簡単な方法を説明する。 図1は、新生ラット海馬神経細胞の単離および培養するための手順の概略を示しています。開始する前に、我々は、無菌の、ポリ-D-リジンコート、カバーガラスを準備し、4ウェルディッシュでそれらを検索する必要があります。...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K ビュー.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

神経科学

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.