造血中、造血幹細胞は解糖系から酸化的リン酸化への代謝スイッチを受ける。このプロトコルは、マウス造血幹および前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能を評価するために使用することができる。この方法は、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。
96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度で高スループット定量を提供し、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。この技術は、様々な条件下でのHSC代謝に対する化学物質または遺伝子操作の影響を調査するために使用することができる。HSCの多能性を維持する代謝経路の解明に役立つ可能性があります。
現在の研究は主にマウス造血幹細胞と前駆細胞に焦点を当てていますが、プロトコルとこのアプローチは、あらゆる種類の浮遊細胞の分析条件を最適化するために容易に適応させることができます。アッセイの1日前に、細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジおよびユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローディングガイドフラットを保存します。
次に、センサーカートリッジをユーティリティプレートから手動で分離し、ユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、フラックスアッセイキットに付属の200マイクロリットルのキャリブラントでユーティリティプレートの各ウェルを満たし、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻して、センサーをキャリブラントに完全に沈めてください。次に、ユーティリティプレートをキャリブラントでインキュベートし、センサーカートリッジを非二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートし、原稿に記載されている加湿条件に従います。
アッセイ当日に、本文原稿に記載されているように96穴細胞培養マイクロプレートあたり2.5ミリリットルの細胞接着溶液を調製する。フラックスアッセイキットに付属の96ウェル細胞培養マイクロプレートを開き、調製した細胞接着溶液25マイクロリットルを各ウェルの底に分注する。マイクロプレートを蓋で覆い、フード内で室温で30分間インキュベートする。
インキュベーション後、マルチチャンネルピペットまたはアスピレーターを使用して余分な細胞接着溶液を取り出して廃棄し、各ウェルを200マイクロリットルの滅菌超純水で2回洗浄する。フード内部の蓋なしでプレートを30〜45分間空気乾燥させます。調製したマウス系統陰性HSPCsを室温で5分間Gで200倍で遠心分離する。
上清を捨てた後、細胞ペレットを適当なアッセイ培地に再懸濁し、細胞懸濁液を再度遠心分離する。この手順をもう一度繰り返し、細胞を適切な加温アッセイ培地に再懸濁して、50マイクロリットルあたり250,000細胞または1ミリリットルあたり500万細胞の濃度にします。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞接着コーティングされた96ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルの側面に沿って50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加し、次いで50マイクロリットルのアッセイ培地をコーナーバックグラウンド測定ウェルに加える。
コーティングされていない96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルあたり50マイクロリットルの水を加えて遠心分離機バランスプレートを作成する。細胞を室温で1分間、Gの200倍で遠心分離する。プレートを摂氏37度の非二酸化炭素インキュベーターで25〜30分間インキュベートし、細胞付着させる。
30分後、細胞がマイクロプレート表面に安定に接着していることを顕微鏡下で目視で確認した。まず、本文原稿に記載されているように、予め加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地に必要なすべての溶液を調製し、水和センサーカートリッジをインキュベーターから取り出します。センサーカートリッジを持ち上げてキャリブラントから取り出し、キャリブラントと同じユーティリティプレートに取り付けて気泡を取り除きます。
80 ローディング・ガイドをセンサー・カートリッジの上部に平らに置き、文字 A が左上隅に位置するように向きを変えます。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートAに20マイクロリットルの100ミリモルグルコース溶液を分配します.80ローディングガイドフラットをBCローディングガイドフラットに交換し、左上隅の文字Bを方向付けます。ポートBに20マイクロモルのオリゴマイシン溶液22マイクロリットルを分注する.BCローディングガイドフラットの向きを変えて、ポートCの左上隅にある文字Cを見つけ、ポートCに25マイクロリットルの500ミリモル2-デオキシ-d-グルコース溶液を分配します。
次に、解糖系ストレステストのテンプレートを作成またはコントローラーに読み込みます。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、「グループの生成」を押します。プレートマップに移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。
プロトコルで、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。ベースライン測定および各注射後の測定については、測定サイクル数を3に設定し、混合、待機、測定時間を3分、0分、3分に混合する。ソフトウェアで[実行の開始]をクリックします。
コンパウンドを装填し、水和させたセンサーカートリッジから蓋を取り外し、細胞外フラックス分析装置の作業トレイに置きます。キャリブレーションの実行を開始します。播種した細胞を入れたマイクロプレートをインキュベーターから取り出します。
細胞を乱すことなく、ウェルあたり130マイクロリットルの加温前解糖ストレス試験アッセイ培地をゆっくりと加えて、各ウェルの培地容量を180マイクロリットルにし、プレートをさらに15〜20分間インキュベーターに戻します。ソフトウェアの [トレイを開く] をクリックして、タツノオトシゴのサーマルトレイを開きます。校正が終了したら、ユーティリティプレートをセルを含むこのアッセイマイクロプレートと交換し、ロードセルプレートを押して測定を開始します。
測定が終わったら、細胞を乱すことなくアッセイ培地をプレートから取り出し、細胞を脱落させることなく250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄する。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した10マイクロリットルの放射免疫沈降溶解バッファーを各ウェルに追加し、シェーカー上でプレートを10分間攪拌する。プレート全体をマイナス80°Cで凍結します。
プレートを解凍し、メーカーの指示に従ってデータ正規化のためのタンパク質測定アッセイを実行します。Waveデスクトップソフトウェアを使用してデータファイルを開いて、データを取得して分析します。[正規化]をクリックし、各ウェルの正規化値を貼り付け、[適用]をクリックしてデータを正規化します。
[エクスポート]をクリックし、[解糖系ストレステストレポートジェネレータ]を選択して、分析データをレポートジェネレータにエクスポートします。非解糖系酸性化率は、細胞数が50, 000から250, 000に増加するにつれて上昇するが、200, 000から250, 000の間では最小限にしか増加しない。10ミリモルグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、1ウェルあたり250,000細胞で観察されるECARの最大増加を伴う。
しかしながら、オリゴマイシンの2マイクロモルの注射は、ECARをさらに増加させない。解糖系ストレス試験の同じセットで得られたOCRデータは、複合体5阻害によるオリゴマイシン注射後の有意な低下を示す。解糖系ストレス試験パラメータを計算し、2マイクロモルのオリゴマイシン中のウェル当たり250,000個の細胞をさらなる研究のために選択した。
ミトコンドリアストレス試験では、2マイクロモルオリゴマイシン注射が複合体5の阻害を介してOCRの有意な減少を引き起こすことを示した。FCCPは、HSPC中のOCRを用量依存的に刺激し、2マイクロモルで観察される最大の増加を伴う。0.5マイクロモルのロテノンと0.5マイクロモルのアンチマイシンA注射の混合物は、OCRを非ミトコンドリア酸素消費に対応する最小レベルまで減少させる。
ミトコンドリアストレス試験パラメータを計算し、さらなる研究のためにFCCPの2マイクロモルを選択した。この技術のハイスループットの性質を考えると、ここで説明するプロトコルは、造血幹細胞、造血前駆細胞、および悪性造血細胞における多数の生体エネルギーモジュレーターをスクリーニングするために容易に適合させることができる。タツノオトシゴ分析は、様々な基質および阻害剤の存在下で多種多様な文脈における代謝を測定するために文献において広く使用されている。
