oxphosと解糖系のリアルタイムの生体エネルギープロファイルを調べることは、RPEの健康と機能を特徴付ける重要な要素として浮上しています。高分解能呼吸法は、正常なRPEと病気のRPEの代謝状態を比較する効率的な方法を可能にします。この手法は、酸素消費率、OCRおよび細胞外酸性化率ECARの測定を通じて、oxphosと解糖の両方を同時に探索できるという利点があります。
RPE細胞は代謝活性の高い細胞であり、AMD中に最初に変性する細胞の1つです。それらの代謝機能やミトコンドリア機能を理解することで、新薬の開発が可能になります。はじめに、ヒトRPE培地中の細胞懸濁液を1ウェル当たり100マイクロリットルずつ、各ウェル中の100マイクロリットル当たり20, 000細胞の最終濃度まで添加する。
そして、四隅の井戸を空のままにしてください。マルチチャンネルピペットを使用して、均質な細胞懸濁液を確保するために複数回ピペットを上下に動かします。バックグラウンド補正のために、4つの空のコーナーウェルにのみ100マイクロリットルの培地を追加します。
細胞培養プレートを室温で1時間放置すると、エッジの影響を最小限に抑えることができます。次に、5%のインキュベーターに入れます二酸化炭素37°Cで加湿します。一晩インキュベーションした後、培地を交換する前に、顕微鏡下で細胞を調べて形態と色素沈着レベルを確認します。
その後の検査日には、細胞が特徴的な石畳のような形態とコンフルエントであり、時間の経過とともに色素沈着を獲得することを確認します。アッセイの前日にセンサーカートリッジの水和を確実にするために、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルの脱イオン水を満たし、センサーカートリッジをユーティリティプレートの水に沈めます。約20ミリリットルのキャリブラント溶液を、二酸化炭素を含まない摂氏37度の加湿オーブンで一晩保管します。
高分解能呼吸測定装置の電源を入れ、ソフトウェアを起動して、器具を摂氏37度で一晩安定させます。アッセイ当日、アッセイを実行する少なくとも45分前に、ユーティリティプレート内の水を等量の加温キャリブラント溶液と交換してください。調製した25ミリリットルのフェノールレッドを含まない水戸ストレス試験アッセイ用培地を摂氏37度に温め、チューブトップフィルターユニットを用いてpH7.4調整した培地を真空濾過した。
細胞培養プレートからヒトRPE培地を取り出し、新たに調製したアッセイ培地100マイクロリットルを加えます。次に、アッセイを開始する前に、細胞培養プレートを二酸化炭素を含まない摂氏37度の加湿オーブンに1時間置きます。各センサーカートリッジには、アッセイ中に細胞培養プレートウェルに試験化合物を注入するためのウェルあたり4つの試薬送達ポートがあります。
それぞれのアッセイ培地で医薬品ストックを希釈することにより、それぞれ3ミリリットルのテネックス薬液を調製します。次に、20マイクロリットルのTenex医薬品をポートAに、22マイクロリットルをポートBに、25マイクロリットルをポートCにピペットで入れて、各ウェルで指定された最終薬物濃度を達成します。次に、分析ソフトウェアでテンプレートタブを開き、水戸ストレステストを選択して、グループ定義を入力します。
水戸ストレス試験薬の注射戦略の詳細を入力します。次に、対照または治療のためのアッセイにおける異なる実験群の詳細を入力する。異なるサプリメントとその特定の濃度をベースアッセイ培地に追加するためのアッセイ培地の詳細を入力します。
そして最後に、セルタイプを追加します。次のタブをクリックしてからプレートマップをクリックして、検査中のさまざまなグループを96ウェルプレート上の特定の場所に割り当てます。プレートマップが完成したら、[プロトコル]タブをクリックして、デフォルトのMitoストレステストプロトコルの機器プロトコルを確認します。
次に、アッセイの実行をクリックし、キャリブレーションのためにユーティリティプレートのキャリブラント溶液に沈めたセンサーカートリッジを挿入します。このプロセスには約25分かかり、各バイオセンサーは、既知のpHと酸素濃度のキャリブラント溶液で測定されたセンサー出力に基づいて、独立して校正されます。キャリブレーションが完了したら、ユーティリティプレートを取り外し、細胞培養プレートを挿入します。
ベースライン測定後、機器はポートA薬液を各ウェルに自動的に注入し、混合と測定の3つのループをそれぞれ3分間追跡します。同じパターンは、他のポートでの後続の各薬物注射の後に発生します。実行が完了したら、細胞培養プレートとセンサーカートリッジを取り外します。
品質管理の目的で、すべての薬物ポートとセンサーカートリッジが注入されていることを確認し、ポートに残留薬物が残っていないかどうかを調べます。次に、細胞培養マイクロプレート内の細胞を顕微鏡下で調べ、細胞のコンフルエントな単層を確認した。次に、アッセイ培地を廃棄し、各ウェルに60マイクロリットルの1つの溶解バッファーと交換します。
蒸発を防ぐためにプレートの端をパラフィルムで包み、BCAアッセイを使用してタンパク質含有量を定量する前に、摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れて一晩細胞溶解を助けます。データ分析ごとに、酸素消費率またはOCRおよび細胞外酸性化率またはECAR値を各ウェルのタンパク質のマイクログラムで割ることにより、すべてのデータを正規化します。次に、Excelマクロを利用してデータ分析ソフトウェアを使用してMitoストレステストパラメータを自動的に計算するMitoストレステストレポートジェネレーターをエクスポートします。
水戸ストレス試験で実証されたのと同じ手順に従うことにより、表1および表2に示すように異なるアッセイ培地サプリメントおよび薬物注射を除いて、解糖系ストレス試験を実施することができる。機器は、実行ごとにOCRとECARの両方を同時に測定します。水戸ストレステストの場合、境界計算はOCARの読み取り値に基づいていますが、解糖系ストレステストの場合、パラメーター計算はECARの読み取り値に基づいています。
これは、初代ヒトRPE細胞に対してMitoストレステストを実行して生成されたOCR曲線です。水戸ストレステストパラメータの計算値を棒グラフで表示します。同様に、これは初代ヒトRPE細胞に対して解糖系ストレス試験を実行して生成されたECAR曲線であり、計算は棒グラフとして示されています。
MitoストレステストのためのポートB薬物注射を最適化するために、初代ヒトRPE細胞におけるOCRの増加における2つの脱共役剤の有効性を比較した。BAM15は、FCCPと比較して、BAM15の最大呼吸と予備呼吸能力が有意に高いことからわかるように、ミトコンドリア呼吸能力の向上においてFCCPよりも優れていることがわかりました。アッセイを実行する前日にセンサーカートリッジを水和することを忘れないでください。
この技術により、研究者はRPE細胞の生体エネルギープロファイルをよりよく特徴付け、RPE細胞がさまざまな病原性刺激に応答して代謝の柔軟性を示す方法を理解することができます。
