この方法は、ナチュラルキラー細胞代謝の決定を可能にする。細胞外媒体における酸素消費量およびpH変化を測定することにより活性化における重要なパラメータである。細胞外フラックス分析装置の利点は、完全に自動化されており、細胞量が少ないリアルタイムで最大92サンプルをテストできることです。
したがって、高スループット画面を可能にします。インキー細胞の解糖と呼吸を決定する有効な方法は、クリニックで非常に重要です。乳がんやがんなど、細胞の代謝が損なわれる疾患が多いからだ。
50ミリリットルの円錐管に20ミリリットルのリンパ球分離培地をピペット化することから始めます。チューブを30度の角度に保ちながら、培地上に20ミリリットルの血液を穏やかにピペットします。2 つの流体間に、表示可能で明確に定義されたインタフェースを作成する。
チューブを1000回G.で25分間遠心し、遠心分離機から慎重にチューブを取り出し、ラックに入れます。LSMと血漿の間の界面で細胞の顕著な層の存在を確認してください。10ミリリットルのプラスチックピペットで単核細胞層を軽く吸引し、新しい50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。
単核細胞を45ミリリットルのPBSで2回洗う。そして、5分間Gの800倍でそれらを遠心分離します。ナチュラルキラー細胞またはエンギブを単離するには、PVM海を数え、1ミリリットル当たり8番目の細胞の1倍10〜8番目の細胞でNK分離バッファーに再中断します。
その後、10ミリリットルの細胞懸濁液を新しい50ミリリットルチューブに移します。NK細胞分離抗体ミックスの500マイクロリットルを加えます。そして10マイクロリットルの抗CD3陽性単離抗体は、PBMCに混合する。
室温で10分間インキュベートします。ボルテックス磁気ビーズを PBMCs および抗体に 1 ミリリットル添加します。その後、時折攪拌しながら室温で10分間MIGSをインキュベートします。
35ミリリットルのNK分離バッファーを加え、チューブをマグネットの上に15分間置きます。慎重に側面またはチューブの底部に触れることなく、50ミリリットルのプラスチックピペットで上清を収集します。細胞を数え、5分間Gの800倍に遠心分離します。
可溶性通路15でNK細胞を刺激するために、96ウェルプレートのウェルに10%HSを含むIMDMの100マイクロリットル中の750,000細胞を再懸濁させる。IMDMでは1ミリリットル当たり1マイクログラム、10%HSのヒト通路を希釈する。そして、希釈されたヒト通路15の100マイクロリットルを細胞に加える。
刺激されていない細胞でコントロールサンプルを修復し、両方のサンプルを摂氏37度のインキュベーターに入れます。細胞を48時間刺激し、細胞外フラックスアッセイを行います。実験の前日に、アナライザーをオンにして摂氏37度まで温めます。
検閲カートリッジパッケージを開き、カートリッジをユーティリティプレートから分離します。次に、200マイクロリットルのキャリブラント溶液をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。そして、センサーが完全に水没していることを確認するために中央のカートリッジを戻します。
最適な結果を得るために、カートリッジを一晩摂氏37度で炭酸ガスフリーインキュベーターにインキュベートします。これは適切に加湿しました。接着被覆されたブレードを調製するために、各プレートのウェルに25マイクロリットルの細胞接着溶液をピペット状に塗布する。
室温で20分間インキュベートした。その後、溶液を取り除き、ウェルあたり200マイクロリットルの無菌水でプレートを2回洗います。ウェルを乾燥させるために、細胞培養フード内でプレートを15分間開いたままにします。
遠心分離機は、以前に単離されたNK細胞をGを5分間200回加える。その後、上清を除去し、温めたミトコンドリアストレス試験培地または解糖ストレス試験培地で細胞を洗浄します。ペレット細胞を再度、同じ培地中の好ましい細胞濃度に再懸濁した。
アッセイプレートに十分に当たって180マイクロリットルの細胞懸濁液を置きます。背景補正用のウェルA、A12H 1、H 12をコントロールウェルとして使用してください。これらのウェルズにアッセイ媒体の180マイクロリットルを加えて、炭酸ガスフリーインキュベーターで37°Cで30分間プレートをインキュベートします。
プレートをGの200倍に5分間遠心する。次に顕微鏡下の細胞を観察し、ウェルの底にマノ層を形成することを確認します。さらに25分間細胞をインキュベートする。
摂氏37度に暖かい作業ソリューション。そして、必要に応じてpHを7.4に変更します。ミトコンドリアストレステストまたは解糖ストレステストのために以前に調製した化合物を、水和検閲カートリッジのボードA、B、Cにロードされた検閲カートリッジをプログラムのセットアップ中にインキュベーターに戻します。
細胞外フラックスアッセイプロトコルを設定するには、ソフトウェアを開き、グループ定義を使用して前処理条件を定義します。[プレート マップ] タブを使用して、類似した条件を持つウェルのグループを示す背景の補正と空の井戸も示します。次に、プロトコルタブでプログラムを設定します。
プログラムを起動し、センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置きます。キャリブレーションステップの後、アッセイプレートのキャリブラントプレートを、取り付けられたセルに交換します。実行が完了したら、データを取得して分析します。
NK細胞の純度および生存率を評価するために。PVM海および単離されたNK細胞集団からの小さなアレック・ワットを、フローサイトメトリーによって染色し、分析した。NK細胞集団の純度はCD3とCD56またはNKP46に対して二重に滞在することによって確立された。
ヒトNK細胞のミトコンドリア酸素消費量の多くをここに示す。予想通り、私のセル番号は、より高いOCR値を表示しました。細胞数はまた、ウェル内のDNAまたはタンパク質の量と線形に相関した。
一方、セル数が多いほど最適ではなかった。DNPを添加すると、各サイクルでウェル中の酸素濃度が完全に枯渇したためです。これはOCRの正確な計算を妨げました。
ヒトNK細胞において、100マイクロモルDNPが最適用量であることが判明した。ウェル当たり750,000個のNK細胞を用いた典型的なミトコンドリアストレス試験実験を示す。このテストでオリゴマイシンは酸素消費量の劇的な減少につながります.
そして、ECARの増加。これは、解糖への切り替えと細胞のATPレベルを維持するための努力を表しています。通路15によるNK細胞の活性化は、ミトコンドリア酸素消費量および細胞外酸性化の両方の増加を引き起こした。
基底の最大およびATPの結合呼吸は増加したが、陽子漏れまたは非ミトコンドリア呼吸ではない。さらに、OCR/ECA率はIL15刺激後の解糖代謝へのシフトを示す減少した。このプロトコルを実行する際には、純粋で健康な細胞集団を得て、最適な細胞数を決定し、非ケーブルの濃度を計定することが非常に重要です。
