このプロトコルは、2つの主要な生体エネルギー経路のリアルタイム分析を提供します: ミトコンドリア呼吸と解糖分解は、新たに解剖されたex vivoマウスのレチン組織で.伝統的なタツノオトシゴの分析は培養された単層細胞に焦点を当て、このプロトコルは、研究者が解剖たばかりの組織、特にレティナにおけるミトコンドリア活性を研究することを可能にする。この技術は、ミトコンドリアの活動と受け継がれ変性マウスモデルのレティナにおける解糖フラグを研究するために使用される。
これは、肛門研究に有用なツールであり、潜在的な治療法を開発するために他のタイプの組織に適用される可能性もあります。このプロトコルの最も難しい部分は、新たに解剖されたマウスのretinaから品質のパンチディスクを得るですので、この技術を実行する個人は、良好な脱剖スキルを持っていることをお勧めします。実験の前日に、センサーカートリッジカセットを開き、ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルのキャリブレーション媒体を追加します。
フルオロフォアを活性化するために摂氏37度の炭酸ガスを含まないインキュベーターで一晩インキュベートします。実験当日、ストックから希釈化合物の薬でアッセイ培地を調製します。摂氏37度の水浴でアッセイ媒体を温めます。
テキスト原稿に記載されているように、マシン上でアッセイプログラムを設定します。メッシュインサートを含むカセットの蓋を開きます。各メッシュインサートにコーティングミックスのピペット8マイクロリットル、ピペットチップを使用して液滴を穏やかに広げ、メッシュインサート全体にコーティングミックスを均等に分配します。
カセットを閉じ、メッシュインサートが吸収のために少なくとも25分間室温でインキュベートできるようにします。インキュベーション後、アッセイ媒体の4ミリリットルを直接インサートにピペットしてメッシュインサートを洗浄します。カセットを軽く振って、すべてのメッシュインサートがアッセイ媒体で洗浄されるようにします。
レチナルパンチを準備するには、大人の安楽死マウスから目を外核にし、ペトリ皿の氷冷PBSに入れ、ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置きます。マイクロシザーを使用して視神経を切断し、眼球の外側に取り付けられた余分な筋肉を慎重に取り除きます。30ゲージ針を使用して、角膜の端に穴を開けます。
その後、角膜の端に沿って円形のカットを行うために細かい解剖マイクロシザーを使用しています。鋭利解鉗子を使用して、眼球カップから角膜、レンズ、そして膜のユーモアを取り除きます。細かい解剖マイクロシザーを使用して、アイカップの縁部の硬化層にいくつかの小さなカットを行います。
両側の強膜組織に保持し、神経性の残膜から除去するために非常に慎重に強膜層を引っ張るために2つの鋭い解離鉗子を使用してください。すべてのクリンラが取り除かれ、無傷のレチンカップが得られるまで、アイカップの周りでこれを繰り返します。それを平らにし、解剖マイクロシザーを使用していくつかの異なるセクションを生成するために、レティナルカップの放射状のカットを行います。
次に、直径1ミリメートルの生検パンチャーを用いて、扁平したレチナルカップの各部から1枚のレチナルディスクを切断する。視神経の頭部から等しい距離でパンチ。鉗子を使用して解剖ペトリ皿に事前コーティングされたメッシュインサートを移します。
2つの超細かいまつげブラシの助けを借りて、メッシュの表面を下にして、メッシュの中央にレチナルパンチディスクを置き、メッシュと感光体層を上に向けて、神経節細胞層の下に置きます。センサーカートリッジをロードするには、37°Cインキュベーターから水和センサーカートリッジプレートカセットを取り出します。ハイドロブースターカバーを取り外した後、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。
ピペットチップを45度の角度で保持し、ピペットチップを注入口の反対側の壁に対して傾斜して注入口に挿入することで、適切なポートに注入化合物溶液の所望の容積をロードします。コンパウンドを各ポートに静かに積み込みます。[実行開始]ボタンをクリックして、マシントレイを開いてキャリブレーションのために、センサーカートリッジを機械に取り付けます。
センサーカートリッジをマシンに取り込み、[準備完了] ボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。アセイ媒体の所望の容積を、小地捕獲板の各ウェルに積み込む。鉗子を使用して、レチナルパンチディスクを含むメッシュインサートのリムをつかみ、ペトリ皿から取り出します。
吸収ワイプティッシュのメッシュインサートの底を軽くタップして余分な液体を取り除き、小子捕獲プレートのウェルに入れます。このステップを繰り返し、レティナルパンチを含むすべてのメッシュインサートが、背景補正ウェルと空のメッシュインサートで埋める空の井戸を埋めるアイレットキャプチャプレートに配置されます。2 つの Graefe 鉗子を使用して、各メッシュ挿入物のリムを慎重かつ穏やかに押し、それらが、アイレットキャプチャプレートの底部にしっかりと挿入されるようにします。
装填した小地捕獲プレートを37°Cインキュベーターに5分間置いてウォームアップし、キャリブレーションが完了した後にユーティリティプレートを排出します。レチンブルパンチを含むアイレットキャプチャプレートに交換し、ロードセルプレートボタンをクリックしてアッセイの実行を再開します。実行が完了したら、イジェクトボタンをクリックして、レティナルパンチを含むセンサーカートリッジと小口キャプチャプレートを取り出し、完了ボタンをクリックして、データが自動的にASYRファイルとして保存され、画面が自動的に結果表示に変わります。
OCRトレースと解糖率アッセイを示すミトコンドリアストレスアッセイは、OCRおよびECARの両方のトレースを示し、解剖したばかりの1ミリメートルのレチナルパンチディスクを用いて行った。ミトコンドリアストレスアッセイでは、Bam15をミトコンドリアATP産生からプロトン勾配を切り離すために注入され、OCRが最大レベルに増加した。ロテノーンとアンチマイシンAを注入して、それぞれ複合体1と複合体3でミトコンドリア呼吸を阻害し、OCRの最小レベルへの低下をもたらした。
OCRの最大レベルと基底OCRレベルの最後の測定との差は、ミトコンドリア予備容量を反映しています。解糖率アッセイでは、ロテノーンとアンチマイシンAの注入はミトコンドリア呼吸を停止し、解糖を高く駆動します。解糖症は、ヘキソキナーゼ結合のためにグルコースと競合する2-デオキシdグルコースを注入することによって押収され、ECARは最小限のレベルに低下する。
糖ECAR基底レベルの最後の尺度における糖ECARの最大レベルの差は、解糖分解リザーブ容量を反映しています。信頼性の高いデータを生成するには、レチナルパンチディスクの良質を取得し、1.5時間以内に総解剖時間を制限することが重要です。実験に続いて、ウェル内のレチンディスクのタンパク質含有量のDNAを定量化し、それを使用してタツノオトシゴのデータを正規化することができます。
そこで、このプロトコルは、レティナの発達、老化、疾患を研究するために利用されました。グルコースや脂肪酸などの異なる燃料基質に対する組織の好みまたは依存性も分析した。
