The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

この原稿で説明するすべての手順は、英国内務省の規制に従っているとケンブリッジ倫理審査パネルによって承認されています。 1.検体採取<ol><li>午後には（男性につき2人の女性まで）成人男性で8〜12週齢の雌のC57BL / 6マウスを用い時限交配を設定します。次の日に早朝に交尾の印として膣栓の存在を確認してください。午前中にプラグの存在はgd0.5をマーク。 </li><li> gd9.5で、頚椎脱臼により動物を安楽死させると、腹腔を開きます。 CO 2によって安楽死は、血管拡張を引き起こす可能性があることに注意してください。 </li><li>静かに子宮動脈（ 図1、破線の矢印）を連結するためにデンタルフロスを使用してください。子宮頸部の周りだけでなく、卵巣に各子宮角、近位の先端に動脈周囲にフロスを接続します。 注意：これは崩壊した動脈をもたらすことができるように血管を破裂しないでください。 </li> &lt;李は&gt;子宮角と子宮頸部の先端にある3つの連結点に遠位全体子宮を切除、解剖ハサミを使用してすぐに子宮を解剖します。 </li><li>両方の角が子宮頸部から反対方向に同じ長軸に​​沿って整列されるように準備されたポリスチレン片に子宮を置きます。静かにそれを伸ばし、2-3、25G針を用いて、所定の位置にピン。 </li><li>準備50mlコニカルチューブにポリスチレンを浸し。 10％ホルマリンで50 mlまでトップ。室温で5-6時間、固定してください。 </li><li>ホルマリン溶液を捨て、5分間50mlで1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を交換してください。 </li><li>各末端での連結点に近位に2子宮角を切除し、近位中央に子宮頸部に、移植部位の周りの余分な脂肪を切り取るとホルマリンの痕跡を除去するために5分間PBSで2回洗浄します。 </li><li>処理まで4℃（最大2週間）で、70％エタノール中のサンプルを保管してください。 注意：Ethとノールは非常に可燃性です。 </li><li> 表1に示すパラメータを使用して自動処理システムを使用する。これらは、子宮の長軸に垂直な平面に沿って切断することができるように、パラフィン中に個別に角を埋め込 ​​みます。これは、各移植部位の最大面積は、ブロック（ 図2A）の中央に分析のために露出されることを保証します。 オプション：必要に応じて、これは、ブロックのランダム化のための便利な時点です。 </li><li>ミクロトームを使用して、ブロックから7ミクロンの厚さの連続切片を切りました。ヘマトキシリン​​およびエオシンを持つすべての49μmの間隔で一つのセクションを染色（H＆Eは、2.1節を参照）。 SMA染色および他のダウンストリームアプリケーションのための室温​​で残りのセクションを保管してください。 </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> 溶液 </td><td style="width:43px;"> 時間<html></td><td style="width:97px;"> 温度 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100％エタノール</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21">：21px; &quot;&gt;キシレン</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">キシレン</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">キシレン</td><td> 1時間</td><td> 40°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">パラフィン</td><td> 1時間</td><td> 63°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">パラフィン</td><td> 1時間</td><td> 63°C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">パラフィン</td><td> 1時間</td><td> 63°C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;">パラフィン</td><td> 1時間</td><td> 63°C </td></tr></tbody></table> 表1：子宮組織の処理のために使用される設定の自動化組織処理の設定の概要 2. STEReological評価<ol><li> H＆E染色<ol><li>室温で10分間、100％キシレン浴にスライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。 注意：キシレンは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。この作品は、個人用保護具（P​​PE）を使用して、ドラフト内で行わなければなりません。 </li><li>さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。 </li><li>順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび精製水を含む浴にスライドを浸します。 </li><li> 5分間、精製水で希釈し、50％ギル無3ヘマトキシリン​​溶液中でスライドを浸します。 注意：ヘマトキシリン​​は、経口摂取や目に接触すると有害です。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 </li><li> 10分間水道水の下で染色トラフでスライドを洗浄します。 </li><li> 10秒間、1％の酸/アルコール溶液（70％エタノール中の1％〜10 M塩酸）中でスライドを浸し水道流水で染色トラフで洗います。 </li><li> 30秒間エオジン液にスライドを浸し、10分間水道水の下で染色トラフで洗います。 </li><li>換気フード内で、連続して5分ごとに70％エタノール、95％エタノールおよび100％エタノールを含有する浴中にスライドを浸します。 </li><li> 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。 </li><li>マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させます。 </li></ol></li><li>容器のサイズとリフォームの状態の立体評価<ol><li>各移植部位については、正中矢状点に近接したセクションを決定します。胎児と胎盤の開発の間の漿尿取り付けは正中矢状点の良い指標となります。 </li><li>分析のための正中矢状点に近い49μmの間隔で3つのセクションを選択します。選択したスライドをスキャンします。 INCを避けるためにより末梢移植部位16に位置することが示されているluding静脈は、各移植部位（ 図2A）の中央の2/4に分析を制限します。 </li><li>内腔のサイズを評価するために、血管の内側の周りに描画し、この形の面積を記録します。総血管サイズのために、内皮細胞、周皮細胞および学​​内の白血球を含む、血管の外壁を中心に描きます。 注意：ルーメンの総血管サイズの比率は、血管の改造ステータスのプロキシです。血管がセクションに沿って切断した面を介してコイルのように、一のスライドに同じ動脈の複数の断面があるかもしれません。同じ動脈を複数回測定することは避けてください。 </li><li>最大かつroundestルーメンで、各移植部位の5隻からの測定値を記録します。三重の各移植部位を（の3つのセクションでは、49ミクロン互いに離間）を測定します。これらの15の測定値のrepreseの平均最大の血管の平均直径をNTS。 </li><li>いくつかのサンプルで、より大きな血管の過剰発現を避けるために、各移植部位における血管の同じ数を測定します。 </li></ol></li></ol>免疫組織化学を使用した定性的評価<ol><li>脱パラフィンおよび再水和<ol><li>室温で10分間、100％キシレン浴に耐熱スライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。 </li><li>さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。 </li><li>順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノールおよび70％精製水を含有する浴中でスライドを浸します。 </li></ol></li><li>抗原回復<ol><li>精製水中の10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液を調製し、10 M塩酸を用いてpHを6に調整します。 </li><li>十分なワットを含む国内の圧力鍋で400ミリリットルのクエン酸ナトリウム緩衝液と場所で600ミリリットルを保持できる耐熱容器を満たしますerは、容器の半分を沈めました。緩く沸騰するまで圧力鍋と熱のふたを取り付けます。 </li><li>場所スライドラックをクエン酸ナトリウム緩衝液中にしっかりと圧力鍋の蓋を固定します。加圧された後、3分間沸騰することができます。 </li><li>圧力鍋を減圧し、内側容器を取り外します。スライドを室温で10分間クエン酸ナトリウム緩衝液中で冷却します。 </li><li>洗浄は、5分間の精製水を含む浴中にスライドします。 </li><li>疎水性バリアペンを使用してセクションを取り囲みます。 </li><li> 5分間PBSに浸漬することによって、スライドを洗浄します。 </li></ol></li><li>内因性ペルオキシダーゼをブロックし、非特異的結合<ol><li>室温で30分間加湿チャンバー内に精製水で希釈した3％過酸化水素で切片をインキュベートします。 注意：過酸化水素は、皮膚や摂取時、目に非常に刺激性です。適切なPPEを着用してください。 </li><li>過剰の過酸化水素溶液をオフにタップして、SLI洗いますDESは二回トリスに浸すことにより、2分ごとに、生理食塩水（TBS）をバッファリング。 </li><li>マウス免疫グロブリンを、製造業者の説明書に従って調製し、マウスキットのマウスからのブロッキング試薬で切片をインキュベートします。 </li><li>洗浄は2分間ずつ二回、TBSでスライドします。 </li></ol></li><li>平滑筋アクチンの免疫検出<ol><li> （キットに付属）抗体希釈液を調製し、室温で5分間、切片とインキュベート、または製造業者の指示に従って。 </li><li> 1希釈：抗体希釈液中の100マウス抗ヒト平滑筋アクチン（DAKO M0851）。最終免疫グロブリン濃度は、両方のソリューションで同等であることを確認して、抗体の希釈液にマウスIgG2aアイソタイプコントロールを希釈します。 </li><li>希釈した抗体またはアイソタイプコントロールソリューションのいずれかで過剰な抗体希釈液とカバーセクションをオフにタップします。室温で30分間加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li>ウォッシュはのためにTBSで二回スライドします各2分。 </li><li>ビオチン化抗マウス二次抗体を希釈し、室温で10分間、切片をインキュベートし、または製造業者の指示に従って。 </li><li>ウォッシュは、それぞれ2分間、TBS、PBSで一回、各スライドします。 </li><li>製造元の指示に従って、3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製します。 DAB溶液で切片をカバーし、最大4分間インキュベートし、過剰な発色を回避するために、セクションを監視するように保証します。 注意：DABは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 </li><li>染色の所望の強度に達すると精製水にスライドを浸し。 </li><li> 20秒間50％のギル号3ヘマトキシリン​​で対比染色し、水が透明になるまで実行される水道水の下で染色トラフで洗います。 </li></ol></li><li>脱水および取り付け<ol><li>ヒュームフードの中で、順次70％のETHを含む浴中にスライドを浸しますノール、95％エタノールで5分間ずつ100％エタノール。 </li><li> 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。 </li><li>マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させ</li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここに提示されたプロトコルは、妊娠の成功のために必要な血管の変化を評価することにより、再現性のある方法を提供するように設計されています。この評価の成功のための重要な組織切片の品質です。正確に移植部位の妊娠期間を決定するだけでなく、確実に子宮動脈を結紮どちらも非常に重要なステップです。等の固定の時間、組織処理プロトコル、等のパラメータの変化も結果に影響を与え得ます。公平な立体評価のためには、各移植部位における血管の同じ数を測定することが重要です。これは、移植部位と三重の各移植部位あたり5隻を測定することをお勧めします。これらの15の測定値の平均が5最大血管の平均サイズを表します。 - / - IL2RG - / -さらにalymphoid RAG2からデータをここに示したマウスは、このprotのを見つけました阻害したNK細胞14のいずれかを含む不適切な母体の免疫機能のモデル数のocol便利。動脈リモデリングの欠陥はまた、障害の栄養膜浸潤18のモデルで示されており、ここに記載された技術は、これらの場合に、血管系を評価することが有益であり得ます。我々は、最適化、検証、このプロトコルをマウスで妊娠中期に脱落膜血管リモデリングの調査のために、それは他のモデル系（例えばラット）で、あるいは他の臓器で動作するように、このプロトコルを適応させることも考えられます。我々は、NK依存リモデリングがロバストgd9.5で評価することができることがわかりますが、このような母体血管系が完全に改造されgd12.5、などの他の時点のために改正することができます。この時点で、血管内栄養膜浸潤は16より深くであり、この時点では血管の変化のために、栄養膜の役割の調査のために、より適切であり得ます。追加の量的な読み出しが必要な場合は、研究者らはまた、SMAのために染色した切片の数を増やし、各移植部位内で部分的に改造船の割合を評価することができます。 このプロトコルの制限は、組織学的検査の記述的な性質です。機能アッセイは、しかし、ゆっくりとしか（例えばドップラー超音波19として）利用可能になってきています。これらの技術は、機器を取得し、維持するための技術的な専門知識とはるかに高い費用が必要ですが、組織学的に観察することができ、変更の影響をin vivoでの読み出しの縦を提供するという利点を有します。すべての立体検査の可能な欠点は、研究者の主観です。この目的を達成するために、独立して、すべてのサンプルを分析する二つの独立した審査官を使用すると、この問題を回避するのに役立ちます。ここで概説したプロトコルは多くの血液が胎児母体の界面に到達することができる方法への洞察を与えるが、それはCOMPLとそれを組み合わせることが有利であり得ますプラスチックを通して血管系における任意の時点で血液の総量を評価するementaryアプローチは、16をキャスト 。 このプロトコルの強度は、2つの独立したアプローチを組み合わせることです。血管の変化は、最初の定量的立体学によって評価され、その結果は、免疫組織化学を用いて定性的に検証されます。結果の信頼性をさらにサンプルをランダム化することによって強化することができます。このプロトコルのために調製された試料は、容易に厳密に妊娠中期での妊娠の表現型を評価するために、そのような目的の細胞のdecidualisation、妊娠のmesometrialリンパ集合（MLAp）の開発や免疫などの妊娠の他のパラメータを調査するために使用することができます。 動脈リモデリングは女性で合併症のない妊娠のための重要なステップであり、これらの変更の失敗は偉大な産科症候群（GOS）、すなわち、子癇前症、胎児の成長制限を支えると死産。ここでは、慎重にGOSの病態生理のいくつかの特性を模倣するマウスモデルにおける妊娠表現型を評価するための手法を提示します。

真獣類の妊娠中の栄養物、ガス及び老廃物の交換は、胎盤によって媒介されます。女性の生殖器官で、子宮動脈は子宮への血液の主な導管があります。注入後、専門の船にこれらのブランチは、胎児胎盤ユニットに向かって基底脱落膜を介してコイルらせん動脈と呼ばれます。直径特に子宮ナチュラルキラー（UNK）細胞では、白血球に囲まれているこれらのらせん動脈の弾力性は、胎盤1,2にボリュームと利用可能な血液の速度を決定します。らせん動脈のリモデリングの結果として正しいの血行動態の変化は、妊娠の成功のために重要です。 根底にあるメカニズムは、ヒトおよびマウスの妊娠の間に細部では異なるが、両種におけるリモデリングプロセスの最終結果は、平滑筋層を失う拡張、高コンダクタンスの血管系です。マウスでは、UNK細胞由来インターフェロン（IFN-）γは、妊娠中期3-5付近でこれらの変化を誘導することが必要です。 NK細胞またはIFN-γシグナル伝達経路の成分のいずれかを欠くマウスは、これらの変更を受けることができず、これは、胎児胎盤部に十分な血液供給の重要性を強調し、低減胎児成長6,7に関連しています。初期の人間の妊娠中、間質および血管内絨毛外栄養膜の浸潤およびUNK細胞との相互作用は、血管の変化を誘導し、胎児の成長の8-10を促進するために重要です。コロニー刺激因子（GM-CSF）12 - UNK細胞は、ケモカイン11と、このような顆粒球マクロファージなどのサイトカインを介して人間の栄養膜の浸潤を調整することができます。浅い栄養膜浸潤は、子癇前症9に低減動脈リモデリングと妊娠合併症に関連付けられています。 このプロトコルは、重要な記述アンクロイの先駆的な研究に基づいています免疫組織化学とエレガントな転送実験5,13を介して、成功した血管リモデリングのための免疫系、特にNK由来のIFN-γの役割。ここでは、らせん動脈の改造の状態を評価するための迅速かつ経済的な方法を説明します。私たちの研究室は、日常的に妊娠中期（妊娠日（GD）9.5）14でこれを評価しますが、リモデリングプロセスはgd8.5 12.5 15との間で行われます。自動スライドスキャナーの登場は、大いにセクションから血管内腔面積の評価を容易にした、我々は、これは血管の直径を測定するよりもより再現性のアプローチであることが判明します。 SMAの免疫組織化学的検出の添加は立体評価から得られた結果の簡単な検証を可能にします。すべての立体的な技術と同様に、それは、少なくとも2つの審査官に目がくらんで実験として評価を実施することをお勧めします。この目的のために、ランダム化ステップは連続的に切断する際に導入することができますティンサンプルスライドを評価する研究者は、試料が来る実験どのグループから知っているしないように。 このプロトコルの全体的な目的は、妊娠関連の合併症のためのマウスモデルの文脈において、慎重に定義された母体および父系の遺伝子型を有するマウスにおいて、らせん動脈のリモデリングを評価するための信頼できるツールを提供することにあります。結果は正常な胎児の成長のために不可欠である、このプロセスのUNK細胞への依存を強調しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

RAG2 - / - IL2RG - / -マウスは、NK細胞17を含むすべての成熟したリンパ球を欠いており、それらの子宮動脈は、妊娠中期5,14の周りにコンジェニック野生型C57BL / 6（WT）マウスで見られる血管の変化を受けることができません。 - / - IL2RG -この減少改造RAG2の結果/ -マウスは、H＆E染色切片で可視化した （図2）stereologically定量することができる全体の小型船を示す、著しく小さい管腔表面領域を示しています。また、（ルーメン比容器）の相対的な壁の厚さは、血液供給の減少およびより高い血流速度を示唆し、これらのマウスにおけるらせん動脈が高いです。 この定量的な評価は、SMAの免疫組織化学的検出を用いて確認しました。 WTマウスは、血管内のメディアSMAの大部分を失うことが特徴であります妊娠中期によるらせん動脈の。このNK細胞駆動プロセスが行われていない場合、SMAは、容器の培地中に残存し、容易に血管の周りのリング（ 図3）のような免疫組織化学的に検出することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> 図1：gd9.5でのマウスの子宮、子宮角、子宮頸部（青）の相対的な位置を示す概略図の描画とメイン子宮動脈（赤）。子宮角（矢印）および連結点（破線の矢印）の長軸がある示しました。免疫組織化学のためのセクションでは、ビューの平面に沿って切断されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> 図2：妊娠中期での動脈リモデリングの立体的評価（A）の例ASSE。基底脱落膜の中央2/4における管腔およびWT女性からのH＆E染色切片上の総血管領域のssment gd9.5で（黒い縦により区画は、破線）。高倍率での船舶では、赤のラインは、総血管面積を画定する破線、黄色破線は、管腔面積を画定します。バー= 500μmの（左）、50ミクロン（右）。子宮の長軸がこの方向で水平線です。 WT（C57BL / 6）とRAG2からの総血管面積（右パネル）に管腔領域（左パネル）および管腔面積の割合の（B）の定量- / - IL2RG - / - マウス（C57BL / 6バックグラウンド上）。各データ点は、15の測定値（切片当たり5回の測定、移植部位につき3切片）の平均を表します。バーは群あたりn = 4妊娠11から13の移植部位の平均であり;両側、不対マンホイットニー検定のp値。 WT：野生型。 <img alT =「図3」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; 図3：基底脱落膜における平滑筋アクチンの免疫組織化学的検出 WT（上）とRAG2の代表SMA染色- / - IL2RG - / - gd9.5で（C57BL / 6バックグラウンド上、下）マウス。バー=100μmです。 WT：野生型。

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus at JoVE.com

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K ビュー.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

ビデオ: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

発生生物学

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em&gt;インビトロ</emゼブラフィッシュにおける&gt;卵成熟

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

マウスの早い妊娠の特性の三次元の高周波超音波の新規な使用

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...