毒性試験の手順は、私の研究室の上級研究員であるアショク・アスパスワー博士によって実証されます。当社のプロトコルは、オフターゲット効果を特定し、細胞培養やその他の動物モデルで見逃される可能性のある発見の初期段階で化学物質の微妙な毒性効果を検出します。私たちの技術の主な利点は:それは迅速かつ効率的であり、化学物質の非常に少量、および実験室での基本的な施設を必要とします。
毒性スクリーニングは、結核を引き起こす抗酸菌に対する効率を研究し、さらに前臨床計算のための濃度を決定するのに役立ちます。この方法は、化学物質のオフターゲット効果に関する洞察を使用し、したがって、この方法は、化学物質の毒性が主要な重要性である研究の任意の分野で使用することができます。この方法は非常に簡単で、経験のない誰でも実行できます。
経験のない個人は、慎重に実験を計画し、1つの化合物を使用する必要があります。この方法は、開発中のゼブラフィッシュ胚の表述薬の変化の形で化学物質の毒性効果を提供し、したがって試験された化合物の安全性を提供する。まず、2~5匹の成体雄ゼブラフィッシュと3~5匹の成体雌ゼブラフィッシュを一晩交配タンクに入れます。
朝、自動暗い光サイクルとその後の光サイクルによって繁殖が誘発されるように、ライトをオンにします。動物へのストレスを避けるために、動物が繁殖のために同じ個体を使用する前に2週間休むことを許可する。翌日の正午に、細かいメッシュストレーナーを使用して胚を収集し、E3胚培地を含むシャーレに移します。
シャーレをステレオ顕微鏡の下に置き、胚の各バッチを調べます。不透明な外観を特定し、未受精または死んだ胚として除去します。一晩インキュベーターで28.5度の胚を保ちます。
翌朝、ステレオ顕微鏡で胚を調べ、不健康または死んだ胚を取り除く。慎重に24ウェルプレートの各ウェルに1胚を転送するためにパスツールピペットを使用しています。各ウェルに胚を覆うのに十分なE3媒体が含まれていることを確認してください。
冷蔵庫に摂氏4度で保存されている阻害剤化合物を含むバイアルを取り出します。分析バランスを使用して化合物の適切な量を秤量し、E3培地または別の適切な溶媒中の化合物ごとに250マイクロリットルの100ミリモルストック溶液を調製する。次に、E3培地を使用して、15ミリリットル遠心管の毒性レベルに基づいてストック溶液の連続希釈液を作ります。
各々が1つのDPF胚を含む井戸から、パスツールピペットと1ミリリットルのピペットを使用して、E3水を一列ずつ取り除きます。すぐに、ストック溶液の各希釈液の1ミリリットルを、より低くから始めてより高い濃度に移動する24ウェルプレートの井戸に分配する。対照群に対して、E3水または他の関連する溶媒を加えます。
化合物の名前と濃度を持つ24ウェルプレートにラベルを付け、インキュベーターでプレートを摂氏28.5度に保ちます。ウェル内の化学物質の希釈剤は、24ウェルプレートの側面を密封することによって、インキュベーターで蒸発しないように注意してください。化学化合物の曝露後24時間後、低温殺菌ピペットを用いて、3%高分子量メチルセルロースを含む小さなシャーレ内の各濃度の化合物に曝露された幼虫を移送する。
金属プローブで横に置きます。カメラに取り付けられたステレオ顕微鏡の下にシャーレを置きます。画像を撮り、実験が終わるまで毎日別のフォルダに保存します。
オンライン テーブルまたは印刷シートに、毎日テーブルにすべての観測値を入力します。神経毒性化合物曝露の場合、4~5匹のDPF幼虫は異常な泳ぎパターンを示し得る。その場合は、幼虫の短い30秒から1分間のビデオをキャプチャすることによって、このような変更の記録を作成します。
化学化合物への5日間の暴露の後、胚の半分が各化学物質の半分の最大致死濃度50として死ぬ濃度に注意してください。適切なプログラムを使用して、すべての濃度の胚の死亡率のための曲線を構築します。このプロトコルでは、毒性の評価の重要な部分は、1つの実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。
幼虫に任意の表形異常を誘発する化合物については、化学物質への暴露後1〜5日の期間にわたって24時間ごとに欠陥を記録した。250マイクロモルおよび125マイクロモルの濃度でβCA阻害剤で治療された胚は、対照と比較して様々な現象性欠陥を示す。例えば、3日目でも孵化していない胚は、湾曲した身体構造、未利用の黄身嚢および心膜浮腫、および治療後5日で幼虫に耳鼻嚢が存在しない。
別の研究では、CA阻害剤で治療された胚は、オトリス嚢および水泳膀胱の欠如を示した。実験は、500マイクロモルで胚発生中に最小限または全く表現型変化を誘発しない代表的な炭酸脱水酵素9を同定した。化合物は高いLC50濃度を示した。
しかし、対照と比較して、300マイクロモルで同じ化合物は、5日間の暴露後に幼虫の神経毒性および誘発運動失調であることが判明した。胚の良質は、化学物質の毒性スクリーニングに重要である。良質の胚を得るために、繁殖のために成虫ゼブラフィッシュの若いペアを使用してください。
安全として出現する化合物は、インビトロおよびインビボ実験に関連する実験を行うことによってさらに特徴付けることができる。抗結核薬の開発の分野では、この技術はゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリウムマリナムのインビボ阻害のためのさらなる実験を設定するのに役立った。プロトコルは、人間に有毒である可能性のある化学物質の使用を含みます.
実験に携わる人は、化学物質を取り扱う際には適切な注意を払う必要があります。
