このプロトコルは、In Vivo 2光子顕微鏡を使用して、長期間にわたって同じ脳の位置で細胞ダイナミクスの反復的な視覚化を行う方法を示しています。この技術の利点は、脳の細胞要素の長期的な変化を、CNSの異なる細胞タイプ間の配置、形態、および物理的相互作用を含む画像化することができることである。この技術は、脳可塑性および神経変性の間に細胞細胞相互作用、細胞ダイナミクス、および形態学的変化を引き出すのに特に有用である。
生後4~10週の若年成人、CX3CR1 GFPヘテロジゴテマウス、重さ17~25グラムのCX3CR1ヘテロジーゴテマウスを頭蓋ウィンドウ移植のために準備することから始めます。マウスを麻酔した後、ヘアトリマーを使用して頭の上、耳の間、ほぼ目の高さから首の領域の上部まで髪を剃ります。マウスを立体性外科手術ステーション、ノーズコーンに移動し、耳棒を使って頭を安定させる。
手順を通して、加熱パッド上のマウスを維持します。両眼を油軟膏で潤滑し、100マイクロリットルの0.25%ブピバカインを注入し、1ミリリットルのデキサメタゾン当たり100マイクロリットルを切開部位で皮下に注入する。続行する前に、少なくとも 5 分間待ちます。
剃った頭部を出血させ、ベタジンの3つの交互の綿棒と70%のアルコールを与えた。その後、外科用ブレードまたははさみで正中の頭皮切開を行います。頭蓋骨領域の後ろから、耳の間、目の間の前頭領域まで延びる。
残りの皮膚を切って頭蓋骨を露出させます。頭皮と下層の頭蓋骨の間に位置する結合組織を3%過酸化水素で出血させ、定位座標で画像化される脳領域を局所化する。歯科ドリルビットを使用して、約4ミリメートルの円形の開口部を頭蓋骨にドリルします。
掘削中、定期的に脳を冷却するために滅菌生理布地と綿棒で頭蓋骨を湿らせた。骨の破片を取り除き、頭蓋骨を柔らかくする。終了したら、尖った鉗子で頭蓋骨のこの部分を慎重に取り除きます。
頭蓋骨を取り除いた後、慎重に頭蓋骨切除術で生理焼けで湿らせた小さなカバーガラスを置きます。無菌ワイプを使用して余分な生理食前を乾燥させます。尖ったアプリケーターを使用して、窓の周りにシアノアクリレート接着剤を適用し、それが脳と頭蓋骨に取り付けることを可能にします。
頭蓋骨の残りの部分にプライマー接着剤を適用し、20〜40秒間硬化光でそれを治します。最後の接着剤で窓の周りに井戸を作成し、20〜40秒間硬化光でそれを治します。頭蓋骨に小さなヘッドプレートを接着, 対側半球, 頭蓋切り毛, プライマー接着剤で, その後、最後の接着剤で, 両方を硬化 20〜40 秒間.
マウスが目覚めた後、術後鎮痛としてブプレノルフィンSRの皮下用量を1回注入し、72時間で十分です。健康的な回復を容易にするために余分な塩の食べ物でマウスを復活させる。画像化は、移植手術後2週間で早くも行うことができる。
ねじを使用してヘッドプレートを2光子顕微鏡ステージに取り付け、暖房プレートで摂氏35度に維持する必要があります。ローダミンB.やさしく綿棒で頭蓋窓の表面をきれいにし、70%エタノールに手を出すような血管色素の100マイクロリットルでマウスを皮下に注入する。窓に水や生理液を数滴入れ、対物レンズを溶液に下げます。
目的が下がるにつれてレーザーがオフになっていることを確認し、接眼レンズを通して、主要な血管のランドマークを示すコースマップを描きます。この図面を使用して、2 光子イメージング中の特定の領域を識別します。2光子イメージングを用いて蛍光細胞や血管の画像を収集します。
画像化パラメータのテキスト原稿を参照し、適切な座標で注意深くメモを取り、その後のイメージングのために正確な領域を再検討できることを確認してください。この最初のイメージングセッションでいくつかの視野のように描きます, イメージングの終わりに, ステージからマウスを取ります, それは麻酔から目を覚ましてできるように, そして、そのホームケージにそれを返します.取得したノートとイメージを使用して、後続のセッション中に領域を再イメージングします。
このプロトコルは、台湾YFP-Hラインマウスで、Vivoでミクログリアダイナミクスを可視化するために使用されました。特定の樹状突起は、脳領域の微細なマッピングのための安定したランドマークとして役立った。樹状突起は安定していますが、一部のミクログリアは毎日移動します。
単一のトランスジェニックCX3CR1/GFPマウスは、最大8週間のミクログリアに従うために使用した。ローダミンBの注射は、血管系を標識するために用いられ、各撮像セッション中に用いた。血管系は安定して固定されたままですが、ミクログリアはダイナミックです。
CX3CR1/GFPマウスを、重度の発作の前後にミクログリアに従うために使用した。血管床構造は維持されたが、微小細胞ネットワーク、および位置景観は一過性であった。発作の24〜48時間以内に大きな変化が観察された。
二重トランスジェニックCX3CR1/GFPおよびNG2DS-赤色マウスは、ミクログリアを追跡するために使用され、NG2は生体内で陽性細胞に対して使用された。血管系に標識を付けることなく、ミクログリアならびに血管関連寄生虫、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞、またはAPCが同定された。寄生虫は血管壁に沿って続く細長いプロセスを有し、APCは通常、血管から離れて脳のパレンチマに存在するより大きな細胞体を示す。
ローダミンBを用いた場合、画像化中の同様の励起にもかかわらず、寄生虫の蛍光が明るい蛍光と輝度ローダミンの薄膜蛍光と区別され得る。毎日のイメージングは、寄生虫が安定して配置され、OpPcとミクログリアが動的であることを示した。視覚化されているエリアを注意深く観察し、できるだけ正確な代表的な地図を描き、出発点に関して他の場所に到達するための手順を示すことは重要です。
以降のイメージング セッションでは、これらの手順、手描きマップ、および以前に撮影した画像が、同じ場所を繰り返し識別する上で重要になります。この技術により、研究者は、健康と病理の両方で、神経とグリアの相互作用、神経免疫相互作用、および長期の神経細胞ダイナミクスを解明することができました。
