海馬におけるミクログリアの役割はまだ完全には理解されていません。このプロトコルは、ミクログリアがどのようにニューロンに接触し、調節するかを直接画像化することができます。海馬の休止中のミクログリアや神経細胞のin vivoイメージングは非常に困難でした。
この方法でこの問題を解決できます。観察窓を埋め込むには、真皮パンチを使用して頭蓋骨に3ミリメートルの円形の溝を作り、溝が以前にマークされた領域と位置合わせされるようにします。真皮パンチが下にある硬膜に触れる前に頭蓋骨の最内層に到達したら、30ゲージの針を使用して中央の骨島をそっと持ち上げます。
次に、硬膜ピッカーを使用して硬膜を慎重に取り除きます。表面からピア、ピアル血管、および皮質組織を吸引します。露出した組織表面の深さを頭蓋窓全体で均一に保ち、外部カプセルの繊維が露出するまで吸引を徐々に深めます。
頭蓋窓の吻側端の側脳室近くの外部カプセルに吸引チップを配置した後、尾側を吻側方向に走る外部カプセルの表層を取り除きます。次に、中外側方向に走っている内層を取り除きます。肺胞の表面と背側の海馬交連の完全な露出をチェックして、外部カプセル全体の除去を確認します。
出血が完全に止まったことを確認した後、頭蓋骨表面の高さまで滅菌生理食塩水で穴を埋めます。次に、ガラス底部が肺胞を軽く押し付け、下にあるCA1を部分的に平らにするまで、管の側面から溢れる余分な水を吸引しながら、ガラス底金属管を穴に垂直に挿入します。歯科用レジンセメントを使用して、挿入したチューブの壁を周囲の頭蓋骨に固定します。
マウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にあるヘッド保持装置と電動XYスキャンステージにセットします。次に、気泡を発生させずに、ガラス底部と対物レンズの間のスペースを水で満たします。パルスレーザーによる連続照明下で、脳実質から放出される蛍光と金属管の端からの反射光のガイダンスで焦点をCA1に調整します。
ガラス底面が撮像面と平行になるようにヘッド保持装置を傾けて、マウスヘッドの角度を調整します。次に、対物レンズの補正環を調整して、CA1のターゲット構造の深さで最高の解像度を達成します。次に、ガラス底面から500マイクロメートルの深さにある歯状回またはDGの分子層内の蛍光細胞が全視野で撮像されていることを確認する。
手術が成功した場合にのみ、DG信号をすぐに検出できます。術後マウスを個々の住居で数週間飼育します。麻酔をかけたマウスを2光子顕微鏡下に置きます。
海馬のイメージングを行います。術後浮腫の軽減後に撮影された画像の品質と強度が、手術日に撮影されたものよりも優れているか、または同等であるかどうかを確認します。ミクログリアが分岐した形態を回復したことを確認してください。
次に、CA1中の目的層に対してin vivoイメージングを行う。手術直後に捕獲されたCX3CR1-GFPマウスのミクログリアは、顕著な活性化を示さなかった。浮腫の誘発なしに手術に成功した後、2光子イメージングの深さはCA1層全体を超え、手術面から500マイクロメートルに達しました。
術後3週間以上の慢性期のミクログリアは、浮腫と炎症の減少により、より高い蛍光強度と分解能、およびより均一な分布を示しました。すべての層のミクログリアはすでに分岐した形態を回復し、不動の細胞体と高度にモーダルなプロセスを示しました。CA1全体の高解像度画像は、数ヶ月間提供されました。
蛍光ミクログリアからのシグナルは、海馬層の識別に役立ちます。肺胞のミクログリアは、軸索路に沿って伸びる細長い細胞体と突起を持っていました。層ピラミッドのミクログリアは、それらのプロセスの密度が低いことで区別できます。
CA1とDGの境界は、境界に沿って走る太い血管によって認識でき、血管にスルホローダミン101を標識することでよりよく認識されました。応用例として、GFP陽性ミクログリアとtdTomato標識錐体ニューロンを同時にイメージングした。ニューロンの標識は、CA1の正確な層構造を理解するのに役立ちました。
最も重要なポイントは、手術の損傷を減らすことです。誤嚥による組織の損傷を避けてください。ガラス底を挿入するときは穏やかな圧力をかけ、歯科用セメントが脳表面に触れないようにしてください。
このアプローチは、海馬におけるミクログリアの役割を特定するのに役立ちます。例えば、ミクログリアがニューロンとどのように相互作用するか、ニューロンがどのように学習に関与しているか、脳疾患をどのように制御するかなどです。
