この研究は、ルンドベック財団、ノボノルディスク財団、デンマーク独立研究評議会によって支援されました |健康老化センターに対する医学とNORDEA財団補助金

動物に関するすべての手続きは、欧州理事会の脊椎動物保護条約に定められたガイドラインに従って、デンマーク国家倫理委員会によって承認された。は ARRIVE ガイドラインに準拠していました。これは、マウスが麻酔回復の前に安楽死させられる末期処置である。
1. 手術前の準備
<ol><li>70%のエタノールで外科テーブルおよびすべての周囲の区域をきれいにする。手術前に手術道具を徹底的に清掃し、乾かしてください。</li>
	<li>NG2DsRedマウス(Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J;両性別;4-8ヶ月齢)ケタミン+キシラジン(60mg/kg+10mg/kg)を殺菌水に溶解して麻酔する。.ケタミンの補足用量(30 mg/kg)を25分ごとに投与し、手術を完了する。尾とつま先のピンチ反射を定期的にチェックして、麻酔の深さを確認します。</li>
	<li>実験中の脱水を防ぐために、マウスの背面の4つの異なる場所に皮下に生理食水を注入し、総体積を1mLにします。目を乾燥から守るために、目の潤滑剤を塗布してください。直腸温度プローブと加熱毛布を使用して、体温を37°Cに維持します。</li>
</ol>2. 外科的処置
<ol><li>気管 切開 術
	<ol>
<li>マウスを背面に置きます。0.5%リドカインの0.04 mLを計画切開下に皮下に注入し、胸骨(マヌブリウム)の上に10mmの長さの切開を行い、2分間待ちます。顎下腺と性突然性腺を分離し、気管を露出させる。</li>
		<li>はさみで2つの気管リングの間に気管切開を行います。長さ16.2mm、直径1mmの小さな金属管を気管に挿入します。チューブを機械式人工呼吸器とカプノグラフに接続して、終末の心電図CO2を監視します(図1A)。</li>
	</ol></li>
	<li>カテーテル挿入
	<ol>
<li>0.5%リドカイン(0.04 mL)を計画切開下に皮下注射し、2分間待つ。</li>
		<li>細かい先端の鉗子を使用して穏やかに静脈から動脈を分離する。微小血管クランプで上流の血流を停止します。両方の血管を結び付ける10-0ナイロン縫合糸で下流の血流を収縮させる。</li>
		<li>動脈と静脈の両方に小さな切開を行うには、微小解剖はさみを使用してください。両方の血管にプラスチック製のカテーテルを挿入します。縫合糸を締め付けることによってカテーテルをしっかりさせる(8-0または10-0ナイロン縫合糸は、カテーテルの内膜を損なうことなく、容器のサイズに依存する)。微小血管クランプを取り外し、皮膚を閉じます。</li>
		<li>動脈カテーテルを介して血圧を監視します。各実験の前後に動脈血中サンプル(50 μL)の血液ガスのレベルを測定します(通常値:pO 2、90-120 mmHg;pCO2、35-40mmHg;pH、7.25-7.45)。フルオレクセインと麻酔の注入には静脈カテーテルを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>開頭術
	<ol>
<li>耳の間にマウスの頭から毛皮を剃ります。0.5%リドカインの0.04 mLを計画切開下に皮下に注入し、2分間待つ。</li>
		<li>10%の塩化鉄溶液を使用して頭蓋骨を拭き取り、骨膜を取り除きます。生理生理で頭蓋骨を十分にすすいでください。シアノクリレート接着剤と活性化剤で頭蓋骨に金属ヘッドバーを接着する(図1A)。 注:金属製のヘッドバーは長さ75mm、幅13.5mmで、中央に直径5mmの丸い穴があります。</li>
		<li>直径4mmの開頭術を、右感覚バレル皮質の上に、0.5 mmの後ろと3mmのブレグマの右側に集中させる。細かい先端容器ディレータで硬膜を取り外します。</li>
		<li>露出した皮質を0.75%のアガロースゲルで覆い、人工脳脊髄液(aCSF;pH=7.4)に溶解し、35°Cまで冷却した。ガラスマイクロピペットの挿入と配置を可能にする金属ヘッドバー(図1B)に10〜15°の角度でガラスカバースリップで開頭術の80-90%をカバーします。</li>
		<li>脳の脈動を最小限に抑えるために、ガラスカバーの2つのコーナーをシアノクリレート接着剤と活性化剤で金属ヘッドバーに接着します。露出した脳に乗るのを防ぐために、アクティベーターを慎重に適用します。その後、接着ガラスカバーを生理食生で十分にすすいでください。</li>
	</ol></li>
	<li>ウィスカーパッド刺激プローブの挿入を行います。カスタムメイドの双極電極(長さ8mm、厚さ0.25mm)を顔の左側に経皮的に挿入し、三叉神経の横側の眼窩を刺激する。陰極をヒアトゥスの眼窩に近づけ、乳骨格筋7に陽極を挿入する。2Hzで20秒の列車で1ミリ秒の強度1.5mAの電気刺激器で刺激を行います。</li>
	<li>手術完了後、0.05mLフルオレセインイソチオシアネートデキストラン(FITC-dextran,4%w/v,分子量[MW]50,000)のボーラスを大腿静脈に投与し、血漿に標識する。ケタミンを中止し、αクロラロースの連続静脈注入(17%w/v、最終濃度)に麻酔を切り替え、FITC-デキストラン(2%w/v、最終濃度)を0.02 mL/10 g/hで混合し、新しい安定化のために約半時間待ちます。麻酔状態。 注:FITC-デキストランとαクロラロースの両方が0.9%の生理生理に溶解されます。</li>
</ol>3. 最初の2フォトンイメージングセッション
<ol><li>市販の2光子顕微鏡(材料表)の段階にマウスを移します。赤色蛍光タンパク質(RFP、図1C)および緑色蛍光タンパク質(GFP、図1C)のエピ蛍光照度モードの両方下で、5倍の目的で露出した皮質の写真を撮る。RFP 画像は、次のセッションでガラスマイクロピペットを挿入するための「マップ」として使用します。 注:GFPの「マップ」は、静脈/静脈を動脈/動脈から区別するために使用されます。</li>
	<li>2光子顕微鏡と25x 1.0の数値開口(NA)水浸し目的をピエゾモーターで使用して2光子イメージングを行います。励起波長を 900 nm に設定します。皮質を検索し、各貫通動脈に従い、その水平枝(第1次毛細血管)を見つけます。</li>
	<li>画像は、静止時およびウィスカーパッド刺激中に動脈およびその第1次毛細血管を貫通する。セクション5の詳細なイメージングパラメータを参照してください。</li>
	<li>RFP 'map' 上のウィスカーパッド刺激中に>5%の血管拡張を持つ第1次毛細血管の位置をマークします(図1 C)。<5% 血管拡張を持つ場所は、ウィスカーバレル皮質領域の外側であると考えられています。 注:実験でNG2DsRedマウスの代わりに野生型マウスを使用する場合、GFP画像は代わりに「マップ」として使用されます。</li>
</ol>4. ガラスマイクロピペットの挿入
<ol><li>ピペットプーラー(材料の表)を使用してパフのためのガラスマイクロピペットを準備します。ガラスマイクロピペットは3-3.5 MΩの抵抗と4.5-5ミリメートルのテーパ長を有し、エピ蛍光ランプと2フォトン顕微鏡の下でピペットの先端を視覚化するために1 mM ATPと10 μM Alexa 594の混合物でピペットをロードします。</li>
	<li>ガラスマイクロピペットをパッチクランプホルダーに取り付け、エアポンプに接続します。ポンプ保持圧力を 0 psi に設定します。</li>
	<li>赤いエピ蛍光照明を使用して、5倍の目的でピペットの先端に焦点を当てます。ガラスマイクロピペットをアガロースの上のACSFに入れます。エアポンプの保持圧力を0.2 psiに調整します。小さな赤い雲がaCSFのピペット先端から排出されるのを観察することができる。これは、ピペット挿入時の目詰まりを防ぐようにする。</li>
	<li>RFP 'map' でマークされている場所のいずれかを宛先として選択します。ピペット先端を 30 μm の距離でカバー ガラスエッジの水平面に移動し、X-y 平面の目的地に向かって大まかに向けます。</li>
	<li>カバーガラスのスリップの下のZ軸のピペット先端を慎重に下げます。その後、脳表面の上に〜500 μmまで目的地に向かってガラスピペットを進め始めます。カバーガラスエッジ、ピペット先端、脳表面の間で頻繁にフォーカスを切り替え、ピペットを動かすのに十分な空き領域があることを確認します。</li>
	<li>目標を 25 倍に切り替えます。ピペット先端を再センターし、RFP'マップ'上の目的地に向かってピペット先端をさらに進めます。アガロース層にピペットの先端を保持します。</li>
	<li>ピペット先端が脳表面より~100μm上の場合は、イメージングモードを2光子顕微鏡に切り替えます。パフするターゲットの場所に焦点を当てます。x、y 座標 (x0、y 0) とサーフェスの下の深さ (z0)を書き留めます。脳表面上の挿入点の座標を次のように計算します。 xi = x0 + z0 / 日焼け yi = y0 θは、ピペット ホルダと水平面の間の角度です。</li>
	<li>ピペット先端を脳表面の座標(xi,y i)に配置します。ピペットが届くまでゆっくりとゆっくりとピペットを挿入します(x 0、y0、z0)。容器が挿入経路の邪魔である場合は、ピペットを撤回し、他の挿入座標とパスを再計算します。またはステージプレートを少し回します(図1Aに示すように)。</li>
	<li>ポンプ保持圧力を0 psi、吐出圧力を10~15psiに設定します。2光子イメージング中のターゲット位置で200〜400ミリ秒のパフATP。ディスカッションセクションで説明されているように、各ピペットと時間の経過とともにパフの圧力と持続時間を調整します。</li>
</ol>5. ハイパースタック 2 フォトン イメージング
<ol><li>ピエゾモーターを用いて2光子顕微鏡と25 x 1.0 NA水浸漬目的を用いて実験を行う。励起波長を 900 nm に設定します。DsRed(ペリサイト)/テトラメチルロダミンイソチオダミンデキストラン(TRITC-dextran)染色血漿およびFITC-デキストラン(血漿)/GCaMP6(GFP、星状カルシウム)から赤色光を収集するために放出された光をフィルタリングします。</li>
	<li>貫通動脈、第1次毛細血管、2次毛細血管およびおそらく隣接する蛍光細胞(例えば、ペリサイト、アストロサイト)を含む目的の位置で高解像度Zスタックを生成する。血管の3D構造を可能な限り含めて、ハイパースタックイメージングのx*y*z体積を決定します。各スタックの全高は30~50μmで、x-y平面は60 μm x 40 μmの面積をほぼカバーします。</li>
	<li>イメージング ソフトウェアのイメージ スタックを、4 ~ 5 μm の平面間距離を持つ 8 ~ 10 平面で構成するように設定します。ピエゾモーターの目的は、各平面の画像を取得するためにZ軸上の各レベルで停止します。サンプリングレートはスタックあたり 1 s で、x-y 平面のピクセル解像度は 0.2~ 0.3 μm です (図 2A)。1 つの記録には、通常、10 のプレパフ 画像スタックと 150 ポスト パフ イメージ スタックが含まれます。</li>
</ol>6. データ処理
<ol><li>カスタムメイドの分析ソフトウェアを使用してデータを処理します。最大強度投影(図2B)により、各画像スタックを1つの画像に平坦化します。対象の血管を垂直に 3 μm の幅で示す長方形領域 (ROI) を描画します (図 2C)。</li>
	<li>赤血球の影や皮質の小さな振動からの干渉を最小限に抑えるために、長方形のROIを1本の線に投影して平均化し、血管セグメントの平均プロファイルを表します。最大強度のイメージごとにこれを行います。</li>
	<li>縦線を 2D イメージとしてプロットし、最大強度のイメージを時系列順に表す X 軸を使用します(図 2D、上のパネル)。アクティブな輪郭アルゴリズム(Chan-Veseセグメンテーション)を使用して、容器8、9(赤い曲線で示される)のエッジを見つけます。図 2D、上部パネル)。</li>
	<li>血管の縁の差(図2Dの上下赤い曲線の垂直距離、下パネル)に合って直径の変化の時間経過を計算します。時間の経過に応じるために、パフ前直径ベースラインとプロットカーブに直径の変化を正規化します。これを ROI ごとに行います (図 2E)。</li>
	<li>容器応答振幅は、パフ後の最高/最低ピーク振幅として定義されます。応答待ち時間は、半最大振幅 (図 2G) の待機時間として定義されます。血管に沿ってノードを配置し(図2F)、各ROIと貫通動脈との間の地理的距離を測定することにより、骨格化血管構造を手動でトレースします。距離を遅延差で除算して CVR 速度を計算します。</li>
</ol>7. ウイルスベクター注入
<ol><li>天体カルシウム応答を同時に研究するために、NG2DsRedマウスの体感覚皮質に0.6 μLウイルスベクター(pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f、Addgene)の体積を注入し、標準的な立体化ウイルスベクター注入手順に従って10.</li>
	<li>3週間後、マウス体感覚皮質のアストロサイトは、遺伝的にコードされたカルシウム指標GCaMP6fを発現する。マウスの前述の外科的処置および2光子のイメージ投射に従う。アストロサイトと血管ルミナを区別するために、FITC-dextranの代わりにTRITC-dextranが容器ルミナを赤く染色するために使用されます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease.">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses.">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks.">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo.">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo.">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex.">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li><li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation.">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li><li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images.">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2++Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo.">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li><li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons.">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726 (2018).</li><li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

著者は何も開示していない。

血管研究の1つの課題は、血管直径の正確な測定です。ここで説明する方法は、2光子顕微鏡による高速かつ反復的なハイパースタックイメージングを行うために、電動ピエゾの目的を使用した。第一に、この方法は、焦点を失うことなく、貫通動脈、第1次および第2次毛細血管の繰り返し検査を可能にし、生体内の毛細血管におけるゆっくりと行われた血管応答の発見につな?...

脳はエネルギー消費率が高い。酸素の約20%と人体が消費するブドウ糖の25%は脳機能に専念し、脳は全体重の2%しか占めかねない。正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワーク内の血流による酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。局所的な脳活動および脳血流(CBF)は、ニューロン、星状細胞、周辺細胞、平滑筋細胞(SMC)および内皮細胞(IC)1の機能特性に応じて、強く結合される。最近、動脈を貫通して分岐する毛細血管の最初のいくつかの注文は、毛細血管血流の活発な調節を示す「ホットスポット」2として出現している。遅い伝導血管応答(CVR)は、ガラスマイクロピペット3を用いてATPのウィスカー刺激と局所的な吐出(パフ)の両方の間にマウスの身体感覚皮質のこの「ホットスポット」で発見された。
2光子レーザー走査蛍光顕微鏡による生体内イメージングでは、大脳皮質における神経血管応答の研究に広く用いられてきたが、ほとんどの研究は血管の直径を測定し、2 次元 (2D) x-y 平面。課題は、まず、脳血管とその受け入れ星細胞、ペリサイト、SMCが3次元(3D)で枝を構築します。したがって、3Dで相互作用を研究することが重要です。第二に、焦点のドリフトの少量であっても、容器の直径と細胞蛍光信号の両方の正確な測定に影響を与えます。最後に、CCVは3次元で高速かつ広範囲に及びます。3D ボリューム スキャンは、CCV を検出し、そのメカニズムを発表するのに最適です。2光子顕微鏡でピエゾモーターの目的を実装し、マウスの体感覚皮質を生体内で研究し、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を可能にした。
ガラスマイクロピペットは、例えば、有機染料4をバルクロードするために、例えば、GMG5を記録し、パッチクランプ6のために、生体内脳研究で頻繁に使用されている。それにもかかわらず、制限は残っています。一般に、ガラスマイクロピペットの先端が不正確に配置されるか、マイクロピペットが局所的介入に使用されない。ここでは、マイクロピペット挿入と局所的な排出の手順を最適化した。
さらに、3D 2光子顕微鏡と遺伝的にコード化された蛍光指標の組み合わせは、3Dスコープで神経血管結合を調べる前例のない機会を提供します。本研究では、これを利用して、アストロサイト特有の遺伝的にコードされたカルシウム指標をマウスの身体感覚皮質に注入した。アストロサイトと血管径は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることにより同時に画像化した。
全体として、ガラスマイクロピペットによる局所的な排出(パフ)と高速2光子ハイパースタックイメージングにより、毛細血管径変化の正確な測定が可能な方法を提示します。さらに、我々の方法は、星状細胞および血管直径応答におけるCa2+応答の3Dプロファイルを同時に研究するための新しいツールを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

正常な脳機能の維持は、血管の複雑なネットワークによる酸素と栄養の十分かつ効率的な供給を必要とします。しかし、脳血流(CBF)の調節は、特に毛細血管レベルで、不完全に理解されていない。2光子顕微鏡は、CBFとその規制を研究するために広く使用される強力なツールです。現在、この分野は、(1)CBF応答を3次元で調べる生体内2光子顕微鏡検査の欠如、(2)血管応答の実施、および(3)血管ネットワーク内の局所的介入の欠如によって制限される。ここでは、2光子顕微鏡を用いて3Dインビボ法を用いて、ガラスマイクロピペットを用いてATPの局所的な駆出によって引き起こされた血管応答を調べた。我々の方法は、得られた画像の最大強度投影による正確な直径測定を提供する高速かつ反復的なハイパースタック2光子イメージングを使用しています。さらに、この方法は、3D星状カルシウム応答の研究にも用いることができることを示す。また、ガラスマイクロピペット挿入と2光子ハイパースタックイメージングの利点と限界についても説明します。

手術が完了すると、マウスを2光子顕微鏡に搬送した(図1A)。1mM ATPを含むガラスマイクロピペットを、標的位置に宛先血管の近くに挿入した(図1B)。
1 mM ATP のパフを与えながらハイパースタックイメージングを行いました (図 2A,補足ビデオ1)各画像スタック...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

ガラスマイクロピペットと高速2光子ハイパースタックイメージング法を用いて最適化された局所突出手順を提示し、毛細血管の直径変化の精密な測定と3次元での調節の調査を可能にします。

ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

このプロトコルは、ATPの局所的な放出によって引き出される脳毛細血管におけるゆっくりとした血管応答を研究するように設計されている。この技術の利点は、局所ピペット放出による局所シナプス活動をシミュレートし、3D 2光子顕微鏡でスキャント容器に焦点を当て続けることです。この方法はまた、脳神経腫と休息時のグリア活性を研究し、3次元の刺激に使用することができます。手順のデモンストレーションはマイケルLになります

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K ビュー.  University of Copenhagen. このプロトコルは、ATPの局所的な放出によって引き出される脳毛細血管におけるゆっくりとした血管応答を研究するように設計されている。この技術の利点は、局所ピペット放出による局所シナプス活動をシミュレートし、3D 2光子顕微鏡でスキャント容器に焦点を当て続けることです。この方法はまた、脳神経腫と休息時のグリア活性を研究し、3次元の刺激に使用する...

ビデオ: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...