EMSは、国立衛生研究所（NIH）からの助成金[助成金番号R01HL120919]によってサポートされていました。米国心臓協会（American Heart Association）[助成金番号10SDG4350046]; NIH [助成金番号UL1 TR000042]からロチェスター大学CTSAの賞を受賞。そしてAAB CVRIからスタートアップ資金。 MATは、ハワード・ヒューズ医療研究所メッド・イントゥ・グラッドイニシアティブから医学と歯学のロチェスター校の大学への助成金によって部分的にサポートされていました。 NIHからと制度ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞[助成金番号GM068411]。

注：マウスを用いたすべての実験は、ロチェスター大学の動物資源上の大学委員会によって承認されました。 1.心外膜伸長文化アッセイ（図1A） <ol><li>準備<ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で199培地（M199）を補完することにより、一次心外膜細胞の単離のための5ミリリットル培地Aを準備します。 </li><li>培地Aプリ暖かい、100mlの37℃の水浴中にハンクス平衡塩溶液（HBSS）。 </li><li>コラーゲンコートしたチャンバースライドを30分間室温まで加温することを可能にします。 </li><li>チャンバースライドの各ウェルに100μlの培地Aを加え、穏やかに均一にコートコラーゲン表面に回転させます。 8-12ウェルについて繰り返します。コー​​ティングチャンバの後にメディアを取り出します。 </li><li>アリコートを50mlのHBSSをそれぞれ含む2つの10 cm 2でプレートにHBSSを事前に温めました。 </li></ol></li><li> 11.5日後に交尾（DPC）で妊娠ダムから胚ハーツを分離します。30 <ol><li>腹腔内注射を介して13 mg / mlでケタミン/ 0.88ミリグラム/ 1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）でミリリットルキシラジンのカクテル0.5mlでマウスを麻酔。つま先のピンチテストを使用して、適切な麻酔を確認してください。穏やかなピンチマウスが応答するかどうかを判断するのに十分です。任意の動きや足の撤退は、動物​​が十分に手術を行うために麻酔をかけないことを示します。頸椎脱臼により安楽死させます。 </li><li>腹側を上に直面しているマウスを置き、毛による汚染を減らすために70％エタノールで腹部をスプレー。 </li><li>鉗子で皮膚をつまみ、手術用ハサミで腹部に横切開をカット。しっかりと肌を持ち、その後、頭と尾に向かって反対方向に引き離します。 </li><li>鉗子で腹膜をつまみ、腹腔を露出させるためにハサミでカット。 </li><li>慎重に子宮間膜に沿って切断することにより、脱落膜を除去します。最初に解剖脱落する予め温めたHBSSを転送10cm 2のプレート。 </li><li>胚の間で切断することにより脱落膜を分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下で予め温めたHBSSで第10cm 2のプレートに胚を転送します。慎重に胚を刎ねるその後、胚体外組織と卵黄嚢を削除します。 </li><li>鉗子で胸壁をつまみ、胸腔を露出させ、正中線で離れて組織を引き裂きます。 </li><li>心の背後に鉗子を置きます。流出路をつかみ、胚から心を引き出します。まだ接続されている場合、心臓から肺の気道および肺を分離します。 </li></ol></li><li>コラーゲン被覆スライドの1ウェルに心を移し、背側を下に（ 図1B）に置きます。各胚のための手順を繰り返し1.2.7-1.3。 </li><li>一度すべての心臓は、コラーゲンマトリックスに十分な付着を可能にするために、37℃、5％CO 2で30分間、チャンバースライドをインキュベートし、個々のウェルに転送されています。 </li><li>慎重に追加それぞれの心臓の周りに予熱した外植媒体Aの20-50μlの。重要：そうでなければ心はコラーゲン基板から切り離すことができる、または心臓の上のレベルにあまりにも急速にメディアを追加しないでください。 </li><li>培養約24時間37℃、5％CO 2での心臓は心外膜成長を可能にします。注：増殖物は、培養早く3-4として時間（ 図1C）を観察し、主に最小限の間葉細胞汚染（ 図1D、E）で石畳の形態を、表示中皮細胞で構成することができます。代表的な結果は、カメラを備えた解剖顕微鏡を用いて取得しました。 </li></ol>心外膜増殖物2.遺伝的アブレーションとEMTの誘導注意：承認されたバイオセーフティガイドラインに従って、慎重にアデノウイルスを処理します。 <ol><li>水浴中で37℃に15ミリリットルを培地B（M199は、1％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）とプリ暖かいを準備します。 </li><li>の切除のためのフロックス対立遺伝子は、Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスの2.5×10 4 PFU / mlの（広告/ CRE）または対照ウイルスを補充した外植片培地Bを準備します。 注：候補遺伝子のアデノウイルス媒介性過剰発現はまた、機能表現型の利得を評価するために行うことができます。ウイルス力価は、エンドユーザによって決定されるべきです。 </li><li>慎重にピンセットを用いて伸長培養物から心外膜枯渇心を取り除きます。後でRNAの単離および遺伝子発現解析のために-80℃で1.5ミリリットルを800μlのTrizolとチューブとストアへの転送の心。 </li><li>血液細胞および過剰な細胞破片を除去するために、DPBSで各ウェルを洗浄します。 </li><li>各伸長培地に500μlのアデノウイルス（ES）を補充した外植片培地Bを添加し、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。 </li><li> EMTの誘導のために、培地を除去し、Bは、組換えトランスフォーミング増殖因子（TGF）-β1[10ng / mLの]またはビヒクル（4mMのHを補充し、37°C​​の外植片の培地を補充ydrochloric酸（塩酸）を含有する1mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA））。 37℃、5％CO 2でさらに24時間培養植片。遺伝子/タンパク質発現を続行すると、後続のプロトコルに詳述されるように分析または免疫細胞化学。 注：心外膜EMTの誘導が0.5 ngの/ mlの範囲のTGF-β1の様々な濃度で刺激された- 10ng / mLの26,31-33。リガンドのより高い濃度は、全てのTGF-β受容体への非特異的結合をもたらすことができます。 TGF-β1の濃度は、特定の実験の目標を反映すべきです。 </li></ol>心外膜増殖物の3遺伝子発現解析<ol><li>以前のTrizol（2.2）に保存されている解凍心外膜枯渇心。 </li><li> EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。 </li><li>文化を外植する800μlの室温のトリゾールを追加します。 </li><li>部屋のtemperatuで5分間のTrizolで心外膜枯渇心とEPDC培養をインキュベート<html>再。溶解サンプルを均質化するまでピペット10回ダウン。 注：ハーツは完全に均質化し、さらにピペッティングが必要な場合があります。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブにライセートを移し、製造者の指示に従って全RNAの単離を進めます。 RNAの収量を増加させるために沈殿の前に10μgのグリコーゲンを追加します。与えられた外植片は約0.5〜1.0μgのRNAが得られます。 </li><li> DNアーゼIとの混入DNAを取り出して、製造者の指示に従って、0.5μgのmRNAのを逆転写。 </li><li>緑の表1に記載したマーカーSYBRを用いて心外膜外植片および/ ​​または定量的逆転写（定量RT）-PCR 34とEMTの誘導の純度を検証する。ノーマライズmRNAレベル-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のグリセルアルデヒドおよび使用相対的発現を計算します2 - ΔΔCT法 35。典型的な結果を図2Aに示されています。 </li></ol>心外膜増殖物のタイトル &quot;&gt; 4。タンパク質分析<ol><li> EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。 </li><li> 10μlの氷冷タンパク質溶解緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mM塩化ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸のpHは8.0、1％トリトンX-100、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）を各ウェルチャンバーへの追加のチャンバースライドを配置氷。 P200ピペットチップで約底の1/4を切り取り、スライドのから細胞をこすり取るために残りの部分を使用してください。上下にピペット心外膜細胞を溶解し、1.5ミリリットルチューブに転送します。 </li><li>超音波処理は、30秒ONとOFFのサイクルで氷水浴中で5分間、低（160 W）で外植片を溶解しました。 </li><li>万XG、4℃で10分間遠心分離溶解液。上清を新しいチューブに移し、タンパク質アッセイ36を用いてタンパク質濃度を決定します。 注：指定された外植片には、最大1.5μgの総タンパク質を得られます。 2 heartsから外植片をプールすることが私たちを発見したANウェル当たりD・ロード2μgタンパク質は平滑筋αアクチン（ACTA2）およびGAPDH 9を検出するのに十分です。他の標的タンパク質の検出は、エンドユーザによって決定されるように、複数の外植片のサンプルをプールする必要ができます。 </li></ol>心外膜増殖物の5免疫細胞化学<ol><li>外植片培養物からメディアを取り出して、DPBSで二回洗います。 </li><li>静かに、それぞれ、C oを -20℃で、室温で5分間または10分間の外植片を各ウェルに4％（v / v）のパラホルムアルデヒドまたは氷冷メタノール500μlのを追加して修正。製造業者によって推奨されるように、抗体の仕様に応じて修正してください。 </li><li> 5分間、3回を固定液を削除し、DPBSで各ウェルをすすぎます。 </li><li> 5分間、DPBS中の0.1％の500μL（v / v）のトリトンX-100で細胞を透過性。 </li><li>透過性溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>室温temperatuで30分間、DPBS中の10％血清で細胞をブロックします再。 </li><li>メーカーの推奨や、エンドユーザによって決定されるような最適な条件ごとに、一次抗体染色を続行します。 </li><li>抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>適切な核色素で、製造元の指示と対比あたりの二次抗体を適用します。 </li><li>抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>製造者の指示に従ってチャンバースライドの壁を取り除き、細胞に直接水性マウント媒体を追加します。細胞の上にカバーガラスを置き、マニキュアで密封します。倒立共焦点走査顕微鏡を用いて、2D -典型的な結果を図2Bに示されています。 </li></ol> 6. ex vivoで培養アッセイ（図3A） <ol><li>準備<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（1：1）の混合物：使用して、12ミリリットルのex vivo培養培地を準備M199は10％を補っFBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li> 37℃の水浴中で、前加温エキソビボ培養培地、100mlのHBSS。 </li><li>アリコートを24ウェルプレートの8-12ウェルに1mlを予め温め培地。 </li><li>転送は、それぞれ50mlを含有する、2つの10 cm 2でプレートにHBSSをあらかじめ温めました。 </li></ol></li><li> 12.5 DPCで妊娠中のダムから（1.2で説明したように）HBSSでマウス胚性心を分離します。 </li><li> ex vivoでの培養培地を含む24ウェルプレートの1ウェルにそれぞれの心を転送します。穏やかに手動で揺動又は付着を防止するために、ロッキングプラットフォームを用いて、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。すぐに7.1に進みます。 </li></ol> 7. 生体外培養における心外膜標識およびEMT誘導<ol><li> 、心外膜にラベルを付ける広告/ GFPの3.0×10 6 pfu / mlでを補充し、37℃ のex vivo培養液の12ミリリットルを調製しました。フロックス対立遺伝子の標的アブレーション、Aの転送6ミリリットルのためにD / GFPは、新しい15ミリリットルコニカルチューブに培地を補いました。広告/ Creを追加または1.5×10 6 pfu / mlの最終濃度にアデノウイルスを制御します。 注意：関数のゲインは、適切なアデノウイルス媒介遺伝子送達を行うことができる分析。 </li><li>慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。 </li><li>静か各ウェルにアデノウイルス（複数可）を補充した培地を追加します。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら24時間、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。 </li><li> EMTの誘導のために、37°C ​​エクスビボを10ng / mlのTGF-β1および20 ng / mlの血小板由来増殖因子（PDGF）-BBまたはビヒクルを含有する培養培地（4mMのHClを含有する1mg / mlのBSAを12mlのを準備）。 </li><li>慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。ゆっくりと1ミリリットルのDPBSで心をすすぎます。 </li><li> DPBSを削除し、ex vivoでの文化と心を補充私TGF-β1およびPDGF-BBまたは車両を含むdium。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。 </li></ol> 8.凍結保存およびex vivoの免疫組織化学文化<ol><li>凍結保存のために心の準備をします。 <ol><li>培養培地を除去し、氷冷DPBSで二回心を洗います。 </li><li>各心臓に4％（v / v）のパラホルムアルデヒドの1ミリリットルを添加して、静かに揺らしながら4℃で2時間固定します。 </li><li>固定液を削除し、DPBSで二回心を洗います。 DPBSで製造した1ミリリットル10％（w / v）のスクロース新鮮なウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>慎重にDPBSで製造した18％（w / v）のスクロースと新しいウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>組織凍結培地を含むcryomoldにそれぞれの心を転送します。直ちに-80＆＃で液体窒素とストアを使用してブロックを凍結176; C。 </li></ol></li><li>正に荷電し、顕微鏡スライド上クライオスタットと場所組織切片を用いて5μmのでセクションの心。ストアは、染色まで-80℃でスライドします。 </li><li>サブ心外膜基底膜の検出のためのセクションに免疫組織化学を実行します。 <ol><li>室温で少なくとも30分間、スライドを解凍。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら5分間、DPBSで2回洗浄することによってセクションを再水和。 </li><li>室温で5分間、PBS中の0.1％（v / v）のトリトンX-100で透過処理部。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら5分間二回DPBSでスライドを洗浄します。 </li><li>過剰DPBSをオフブロットおよび疎水性ラベリングペンで染色領域を規定します。室温で30分間、DPBS中の10％血清でブロックセクション。 </li><li>ブロック中に希釈：IV型コラーゲン抗体（200 ColIV、1）ブロックを削除し、適用します。調湿室で4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>以下のためにDPBSでスライドを3回洗浄穏やかに揺らしながら5分。 </li><li> DPBSでスライドに適用されますし、DAPI（5000 1）：蛍光結合二次抗体（1：500）を希釈します。室温で1時間インキュベートします。 GFPは異なる発光及び励起波長で適切な二次抗体を選択してください。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら5分間、PBS中でスライドを3回洗浄します。マウントは、取り付け媒体と摺動します。 </li></ol></li></ol> 9.イメージングおよびex vivoの定量文化<ol><li>盲検ユーザ画像を持っているし、染色した切片を定量化します。心外膜（心臓のエッジ）40X倍率で、蛍光または共焦点顕微鏡を使用して、に沿って4-5の任意の場所に指定された心からの画像は、少なくとも5つの非連続した組織切片。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3Bに示されています。 </li><li>手動で指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数を数えます。 GFP POとEPDCの移行を識別するColIV心外膜下基底膜内または越えて位置sitive細胞。指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数の上にGFP陽性細胞の移行の数として細胞を移行GFPのパーセントを決定します。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3C-Dに示されています。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、伸長してプライマリ心外膜細胞を分離し、ex vivoでの心臓培養物中のEPDCの移動を追跡するための詳細な方法を概説します。伸長の文化のために、心外膜枯渇心を除去するための適切な時間は、実験間で多少異なります。一晩のインキュベーションの後、外植片の定期的なモニタリングが心外膜伸長の程度を測定すると、線維芽細胞が出現する前に心を抽出することをお勧め?...

心外膜は、中皮細胞の単層であるラインハートと影響心臓の発達、成熟および修理。パラクリン信号の高度に調整して交換を通じて、心筋および心外膜の間の密接な対話が心の成長と非筋細胞、心臓系統1の形成に不可欠です。心外膜由来細胞（EPDC）は上皮-間葉転換（EMT）2を介して心外膜細胞のサブセットから出て、心外膜下空間とその下の心筋に侵入し、主に冠動脈の血管壁細胞と心臓線維芽細胞に分化、およびへより少ない程度、内皮細胞および心筋3-9。 心外膜EMTとEPDCの侵入を調節するメカニズムは、分泌リガンド10-13、細胞表面受容体と接着分子14,15、のRegu含む様々な分子の協調作用に起因するとされています頂端-基底極性16,17のレータ、低分子量GTPase 18,19、および転写は2,20,21因子 。 EPDCの移行の分子エフェクターの多くが定義されているが、胚にEPDC動員を刺激する生理学的信号をよりよく理解することは、改善された心臓修復のために成人にこのプロセスを操作するための戦略の開発を加速することができます。 EPDC動員の新規調節因子を同定することを目的とした研究は、この細胞集団の精製または個々の心外膜細胞の移動を追跡するに依存しています。一つまたはWT1、Tcf21、Tbx18、および/ ​​またはAldh1a2含むマーカー遺伝子の組み合わせは、一般に胎児の心外膜1を識別するために使用されます。心外膜マーカーの発現は、心臓の開発の過程で衰えると心外膜細胞がtransdifを受ける際にしばしば失われるしかし、EPDCを移行追跡するためにこれらのマーカーの使用は最適ではありません間葉系細胞へのferentiation。 Cre / loxPシステムのアプリケーションでは、系統追跡記者と連携して、恒久的に心臓の開発中に心外膜とその子孫を標識し、大人7,22,23における虚血性損傷後に有用でした。いくつかの心外膜制限のCre株が生成されていると広くEPDCを標識し、条件付き遺伝子欠失戦略1のために使用されます。これらの研究は、様々な心外膜の系統の特性評価、およびEPDC運動性および分化の重要なメディエーターの同定につながっています。しかし、蓄積証拠も心外膜は、前駆細胞4,24,25の異種集団であることを示唆しています。このように、心外膜細胞のサブセットのみが与えられたCreドライバを使用して標的化することになります。 かかわらずのCre特異性の全体心外膜を標識するためには、研究室の数が伸長CULを利用してきましたチャーシステムまたはエキソビボ器官培養法を忠実に遺伝的系統マーカー26-28の発現に依存することなく、心外膜細胞を単離するか、標識します。 ex vivoでの移行研究のために、胚の心臓は心外膜EMTの前にし、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アデノウイルス（広告/ GFP）9,18を添加した培地で培養分離されています。このアプローチは、効率的な全体心外膜の標識ではなく、Cre介在組換えによって細胞のサブセットを可能にします。ハート培養物は、その後EPDC 28,29の動員を刺激することがEMTの既知の誘導物質にさらされている。 エクスビボおよびin vivoでの分析EPDCの移行を駆動する詳細なメカニズムを探索するために特に有用なアプローチであるin vitroの心外膜外植片培養物によって補完されています。 ここでは、epicardiのインビトロ研究のための一次心外膜細胞を単離するための方法を記載しますアルEMT、ならびにEPDC運動のex vivo分析のための器官培養系。我々は最近、遺伝的にEPDC 9のアクチンベースの移行を操作するために軸をシグナリングミオカルディン関連転写因子（MRTF）/血清応答因子（SRF）を調節することによって、この方法の有用性と堅牢性を実証しました。我々の知見はEPDC移動を規制するために必要な1つの信号経路を強調しながら、これらの方法はまとめEPDC遊走および分化を調整するメカニズムを解明するのに適しています。また、外植片およびエクスビボ培養系は、心臓再生における治療用途にEPDC動員の新規調節因子を同定するために、機能画面で実施することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

心外膜細胞株の単層心臓、心筋細胞の増殖を刺激するパラクリン因子を提供し、直接開発や病気の際に心臓血管前駆細胞を貢献しています。多くの要因は、心外膜由来細胞（EPDC）の動員に関与してきたが、彼らのその後の移行および分化を支配するメカニズムはよく理解されていません。ここでは、EPDC運動性および分化を研究するための戦略をin vitroで提示し、ex vivoで 。まず、我々はマウス胎児心臓から成長培養によって一次心外膜細胞を得る方法を説明します。我々はまた、器官培養系において標識EPDCの三次元移動を評価するための詳細なプロトコルを導入します。我々は、心外膜でミオカルディン関連転写因子の遺伝子欠失がEPDC移動を減衰させるこれらの技術を使用して証拠を提供します。このアプローチは、EPDCの候補修飾因子を評価するためのプラットフォームとして機能します生物学とは、心臓の修復に有用であるかもしれないEPDC動員の新規な調節因子を同定するための遺伝的または化学的なスクリーニングを開発するために使用することができます。

心外膜は、効率的に外側の位置を利用することと発達可塑性及びEPDCの固有の遊走挙動を利用して成長培養アッセイを用いて単離することができます。マウス胚性心臓を前にダウンコラーゲンコートしたチャンバースライド上の心外膜EMT培養背側にE11.5で分離されている26（ 図1A、B）。外植心臓は収縮していきます。しかし、心外膜はコラーゲンマ...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

心外膜の伸長文化検定と<em&gt; ex vivoで</em&gt;心外膜由来の細胞移動の評価

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K ビュー.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

発生生物学

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

心外膜の伸長文化検定と

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