Name: epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration
Uploaded: 2016-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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EMSは、国立衛生研究所（NIH）からの助成金[助成金番号R01HL120919]によってサポートされていました。米国心臓協会（American Heart Association）[助成金番号10SDG4350046]; NIH [助成金番号UL1 TR000042]からロチェスター大学CTSAの賞を受賞。そしてAAB CVRIからスタートアップ資金。 MATは、ハワード・ヒューズ医療研究所メッド・イントゥ・グラッドイニシアティブから医学と歯学のロチェスター校の大学への助成金によって部分的にサポートされていました。 NIHからと制度ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞[助成金番号GM068411]。

注：マウスを用いたすべての実験は、ロチェスター大学の動物資源上の大学委員会によって承認されました。 1.心外膜伸長文化アッセイ（図1A） <ol><li>準備<ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で199培地（M199）を補完することにより、一次心外膜細胞の単離のための5ミリリットル培地Aを準備します。 </li><li>培地Aプリ暖かい、100mlの37℃の水浴中にハンクス平衡塩溶液（HBSS）。 </li><li>コラーゲンコートしたチャンバースライドを30分間室温まで加温することを可能にします。 </li><li>チャンバースライドの各ウェルに100μlの培地Aを加え、穏やかに均一にコートコラーゲン表面に回転させます。 8-12ウェルについて繰り返します。コー​​ティングチャンバの後にメディアを取り出します。 </li><li>アリコートを50mlのHBSSをそれぞれ含む2つの10 cm 2でプレートにHBSSを事前に温めました。 </li></ol></li><li> 11.5日後に交尾（DPC）で妊娠ダムから胚ハーツを分離します。30 <ol><li>腹腔内注射を介して13 mg / mlでケタミン/ 0.88ミリグラム/ 1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）でミリリットルキシラジンのカクテル0.5mlでマウスを麻酔。つま先のピンチテストを使用して、適切な麻酔を確認してください。穏やかなピンチマウスが応答するかどうかを判断するのに十分です。任意の動きや足の撤退は、動物​​が十分に手術を行うために麻酔をかけないことを示します。頸椎脱臼により安楽死させます。 </li><li>腹側を上に直面しているマウスを置き、毛による汚染を減らすために70％エタノールで腹部をスプレー。 </li><li>鉗子で皮膚をつまみ、手術用ハサミで腹部に横切開をカット。しっかりと肌を持ち、その後、頭と尾に向かって反対方向に引き離します。 </li><li>鉗子で腹膜をつまみ、腹腔を露出させるためにハサミでカット。 </li><li>慎重に子宮間膜に沿って切断することにより、脱落膜を除去します。最初に解剖脱落する予め温めたHBSSを転送10cm 2のプレート。 </li><li>胚の間で切断することにより脱落膜を分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下で予め温めたHBSSで第10cm 2のプレートに胚を転送します。慎重に胚を刎ねるその後、胚体外組織と卵黄嚢を削除します。 </li><li>鉗子で胸壁をつまみ、胸腔を露出させ、正中線で離れて組織を引き裂きます。 </li><li>心の背後に鉗子を置きます。流出路をつかみ、胚から心を引き出します。まだ接続されている場合、心臓から肺の気道および肺を分離します。 </li></ol></li><li>コラーゲン被覆スライドの1ウェルに心を移し、背側を下に（ 図1B）に置きます。各胚のための手順を繰り返し1.2.7-1.3。 </li><li>一度すべての心臓は、コラーゲンマトリックスに十分な付着を可能にするために、37℃、5％CO 2で30分間、チャンバースライドをインキュベートし、個々のウェルに転送されています。 </li><li>慎重に追加それぞれの心臓の周りに予熱した外植媒体Aの20-50μlの。重要：そうでなければ心はコラーゲン基板から切り離すことができる、または心臓の上のレベルにあまりにも急速にメディアを追加しないでください。 </li><li>培養約24時間37℃、5％CO 2での心臓は心外膜成長を可能にします。注：増殖物は、培養早く3-4として時間（ 図1C）を観察し、主に最小限の間葉細胞汚染（ 図1D、E）で石畳の形態を、表示中皮細胞で構成することができます。代表的な結果は、カメラを備えた解剖顕微鏡を用いて取得しました。 </li></ol>心外膜増殖物2.遺伝的アブレーションとEMTの誘導注意：承認されたバイオセーフティガイドラインに従って、慎重にアデノウイルスを処理します。 <ol><li>水浴中で37℃に15ミリリットルを培地B（M199は、1％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）とプリ暖かいを準備します。 </li><li>の切除のためのフロックス対立遺伝子は、Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスの2.5×10 4 PFU / mlの（広告/ CRE）または対照ウイルスを補充した外植片培地Bを準備します。 注：候補遺伝子のアデノウイルス媒介性過剰発現はまた、機能表現型の利得を評価するために行うことができます。ウイルス力価は、エンドユーザによって決定されるべきです。 </li><li>慎重にピンセットを用いて伸長培養物から心外膜枯渇心を取り除きます。後でRNAの単離および遺伝子発現解析のために-80℃で1.5ミリリットルを800μlのTrizolとチューブとストアへの転送の心。 </li><li>血液細胞および過剰な細胞破片を除去するために、DPBSで各ウェルを洗浄します。 </li><li>各伸長培地に500μlのアデノウイルス（ES）を補充した外植片培地Bを添加し、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。 </li><li> EMTの誘導のために、培地を除去し、Bは、組換えトランスフォーミング増殖因子（TGF）-β1[10ng / mLの]またはビヒクル（4mMのHを補充し、37°C​​の外植片の培地を補充ydrochloric酸（塩酸）を含有する1mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA））。 37℃、5％CO 2でさらに24時間培養植片。遺伝子/タンパク質発現を続行すると、後続のプロトコルに詳述されるように分析または免疫細胞化学。 注：心外膜EMTの誘導が0.5 ngの/ mlの範囲のTGF-β1の様々な濃度で刺激された- 10ng / mLの26,31-33。リガンドのより高い濃度は、全てのTGF-β受容体への非特異的結合をもたらすことができます。 TGF-β1の濃度は、特定の実験の目標を反映すべきです。 </li></ol>心外膜増殖物の3遺伝子発現解析<ol><li>以前のTrizol（2.2）に保存されている解凍心外膜枯渇心。 </li><li> EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。 </li><li>文化を外植する800μlの室温のトリゾールを追加します。 </li><li>部屋のtemperatuで5分間のTrizolで心外膜枯渇心とEPDC培養をインキュベート<html>再。溶解サンプルを均質化するまでピペット10回ダウン。 注：ハーツは完全に均質化し、さらにピペッティングが必要な場合があります。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブにライセートを移し、製造者の指示に従って全RNAの単離を進めます。 RNAの収量を増加させるために沈殿の前に10μgのグリコーゲンを追加します。与えられた外植片は約0.5〜1.0μgのRNAが得られます。 </li><li> DNアーゼIとの混入DNAを取り出して、製造者の指示に従って、0.5μgのmRNAのを逆転写。 </li><li>緑の表1に記載したマーカーSYBRを用いて心外膜外植片および/ ​​または定量的逆転写（定量RT）-PCR 34とEMTの誘導の純度を検証する。ノーマライズmRNAレベル-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のグリセルアルデヒドおよび使用相対的発現を計算します2 - ΔΔCT法 35。典型的な結果を図2Aに示されています。 </li></ol>心外膜増殖物のタイトル &quot;&gt; 4。タンパク質分析<ol><li> EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。 </li><li> 10μlの氷冷タンパク質溶解緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mM塩化ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸のpHは8.0、1％トリトンX-100、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）を各ウェルチャンバーへの追加のチャンバースライドを配置氷。 P200ピペットチップで約底の1/4を切り取り、スライドのから細胞をこすり取るために残りの部分を使用してください。上下にピペット心外膜細胞を溶解し、1.5ミリリットルチューブに転送します。 </li><li>超音波処理は、30秒ONとOFFのサイクルで氷水浴中で5分間、低（160 W）で外植片を溶解しました。 </li><li>万XG、4℃で10分間遠心分離溶解液。上清を新しいチューブに移し、タンパク質アッセイ36を用いてタンパク質濃度を決定します。 注：指定された外植片には、最大1.5μgの総タンパク質を得られます。 2 heartsから外植片をプールすることが私たちを発見したANウェル当たりD・ロード2μgタンパク質は平滑筋αアクチン（ACTA2）およびGAPDH 9を検出するのに十分です。他の標的タンパク質の検出は、エンドユーザによって決定されるように、複数の外植片のサンプルをプールする必要ができます。 </li></ol>心外膜増殖物の5免疫細胞化学<ol><li>外植片培養物からメディアを取り出して、DPBSで二回洗います。 </li><li>静かに、それぞれ、C oを -20℃で、室温で5分間または10分間の外植片を各ウェルに4％（v / v）のパラホルムアルデヒドまたは氷冷メタノール500μlのを追加して修正。製造業者によって推奨されるように、抗体の仕様に応じて修正してください。 </li><li> 5分間、3回を固定液を削除し、DPBSで各ウェルをすすぎます。 </li><li> 5分間、DPBS中の0.1％の500μL（v / v）のトリトンX-100で細胞を透過性。 </li><li>透過性溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>室温temperatuで30分間、DPBS中の10％血清で細胞をブロックします再。 </li><li>メーカーの推奨や、エンドユーザによって決定されるような最適な条件ごとに、一次抗体染色を続行します。 </li><li>抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>適切な核色素で、製造元の指示と対比あたりの二次抗体を適用します。 </li><li>抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。 </li><li>製造者の指示に従ってチャンバースライドの壁を取り除き、細胞に直接水性マウント媒体を追加します。細胞の上にカバーガラスを置き、マニキュアで密封します。倒立共焦点走査顕微鏡を用いて、2D -典型的な結果を図2Bに示されています。 </li></ol> 6. ex vivoで培養アッセイ（図3A） <ol><li>準備<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（1：1）の混合物：使用して、12ミリリットルのex vivo培養培地を準備M199は10％を補っFBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li> 37℃の水浴中で、前加温エキソビボ培養培地、100mlのHBSS。 </li><li>アリコートを24ウェルプレートの8-12ウェルに1mlを予め温め培地。 </li><li>転送は、それぞれ50mlを含有する、2つの10 cm 2でプレートにHBSSをあらかじめ温めました。 </li></ol></li><li> 12.5 DPCで妊娠中のダムから（1.2で説明したように）HBSSでマウス胚性心を分離します。 </li><li> ex vivoでの培養培地を含む24ウェルプレートの1ウェルにそれぞれの心を転送します。穏やかに手動で揺動又は付着を防止するために、ロッキングプラットフォームを用いて、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。すぐに7.1に進みます。 </li></ol> 7. 生体外培養における心外膜標識およびEMT誘導<ol><li> 、心外膜にラベルを付ける広告/ GFPの3.0×10 6 pfu / mlでを補充し、37℃ のex vivo培養液の12ミリリットルを調製しました。フロックス対立遺伝子の標的アブレーション、Aの転送6ミリリットルのためにD / GFPは、新しい15ミリリットルコニカルチューブに培地を補いました。広告/ Creを追加または1.5×10 6 pfu / mlの最終濃度にアデノウイルスを制御します。 注意：関数のゲインは、適切なアデノウイルス媒介遺伝子送達を行うことができる分析。 </li><li>慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。 </li><li>静か各ウェルにアデノウイルス（複数可）を補充した培地を追加します。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら24時間、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。 </li><li> EMTの誘導のために、37°C ​​エクスビボを10ng / mlのTGF-β1および20 ng / mlの血小板由来増殖因子（PDGF）-BBまたはビヒクルを含有する培養培地（4mMのHClを含有する1mg / mlのBSAを12mlのを準備）。 </li><li>慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。ゆっくりと1ミリリットルのDPBSで心をすすぎます。 </li><li> DPBSを削除し、ex vivoでの文化と心を補充私TGF-β1およびPDGF-BBまたは車両を含むdium。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。 </li></ol> 8.凍結保存およびex vivoの免疫組織化学文化<ol><li>凍結保存のために心の準備をします。 <ol><li>培養培地を除去し、氷冷DPBSで二回心を洗います。 </li><li>各心臓に4％（v / v）のパラホルムアルデヒドの1ミリリットルを添加して、静かに揺らしながら4℃で2時間固定します。 </li><li>固定液を削除し、DPBSで二回心を洗います。 DPBSで製造した1ミリリットル10％（w / v）のスクロース新鮮なウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>慎重にDPBSで製造した18％（w / v）のスクロースと新しいウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>組織凍結培地を含むcryomoldにそれぞれの心を転送します。直ちに-80＆＃で液体窒素とストアを使用してブロックを凍結176; C。 </li></ol></li><li>正に荷電し、顕微鏡スライド上クライオスタットと場所組織切片を用いて5μmのでセクションの心。ストアは、染色まで-80℃でスライドします。 </li><li>サブ心外膜基底膜の検出のためのセクションに免疫組織化学を実行します。 <ol><li>室温で少なくとも30分間、スライドを解凍。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら5分間、DPBSで2回洗浄することによってセクションを再水和。 </li><li>室温で5分間、PBS中の0.1％（v / v）のトリトンX-100で透過処理部。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら5分間二回DPBSでスライドを洗浄します。 </li><li>過剰DPBSをオフブロットおよび疎水性ラベリングペンで染色領域を規定します。室温で30分間、DPBS中の10％血清でブロックセクション。 </li><li>ブロック中に希釈：IV型コラーゲン抗体（200 ColIV、1）ブロックを削除し、適用します。調湿室で4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>以下のためにDPBSでスライドを3回洗浄穏やかに揺らしながら5分。 </li><li> DPBSでスライドに適用されますし、DAPI（5000 1）：蛍光結合二次抗体（1：500）を希釈します。室温で1時間インキュベートします。 GFPは異なる発光及び励起波長で適切な二次抗体を選択してください。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら5分間、PBS中でスライドを3回洗浄します。マウントは、取り付け媒体と摺動します。 </li></ol></li></ol> 9.イメージングおよびex vivoの定量文化<ol><li>盲検ユーザ画像を持っているし、染色した切片を定量化します。心外膜（心臓のエッジ）40X倍率で、蛍光または共焦点顕微鏡を使用して、に沿って4-5の任意の場所に指定された心からの画像は、少なくとも5つの非連続した組織切片。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3Bに示されています。 </li><li>手動で指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数を数えます。 GFP POとEPDCの移行を識別するColIV心外膜下基底膜内または越えて位置sitive細胞。指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数の上にGFP陽性細胞の移行の数として細胞を移行GFPのパーセントを決定します。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3C-Dに示されています。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、伸長してプライマリ心外膜細胞を分離し、ex vivoでの心臓培養物中のEPDCの移動を追跡するための詳細な方法を概説します。伸長の文化のために、心外膜枯渇心を除去するための適切な時間は、実験間で多少異なります。一晩のインキュベーションの後、外植片の定期的なモニタリングが心外膜伸長の程度を測定すると、線維芽細胞が出現する前に心を抽出することをお勧め?...

心外膜は、中皮細胞の単層であるラインハートと影響心臓の発達、成熟および修理。パラクリン信号の高度に調整して交換を通じて、心筋および心外膜の間の密接な対話が心の成長と非筋細胞、心臓系統1の形成に不可欠です。心外膜由来細胞（EPDC）は上皮-間葉転換（EMT）2を介して心外膜細胞のサブセットから出て、心外膜下空間とその下の心筋に侵入し、主に冠動脈の血管壁細胞と心臓線維芽細胞に分化、およびへより少ない程度、内皮細胞および心筋3-9。 心外膜EMTとEPDCの侵入を調節するメカニズムは、分泌リガンド10-13、細胞表面受容体と接着分子14,15、のRegu含む様々な分子の協調作用に起因するとされています頂端-基底極性16,17のレータ、低分子量GTPase 18,19、および転写は2,20,21因子 。 EPDCの移行の分子エフェクターの多くが定義されているが、胚にEPDC動員を刺激する生理学的信号をよりよく理解することは、改善された心臓修復のために成人にこのプロセスを操作するための戦略の開発を加速することができます。 EPDC動員の新規調節因子を同定することを目的とした研究は、この細胞集団の精製または個々の心外膜細胞の移動を追跡するに依存しています。一つまたはWT1、Tcf21、Tbx18、および/ ​​またはAldh1a2含むマーカー遺伝子の組み合わせは、一般に胎児の心外膜1を識別するために使用されます。心外膜マーカーの発現は、心臓の開発の過程で衰えると心外膜細胞がtransdifを受ける際にしばしば失われるしかし、EPDCを移行追跡するためにこれらのマーカーの使用は最適ではありません間葉系細胞へのferentiation。 Cre / loxPシステムのアプリケーションでは、系統追跡記者と連携して、恒久的に心臓の開発中に心外膜とその子孫を標識し、大人7,22,23における虚血性損傷後に有用でした。いくつかの心外膜制限のCre株が生成されていると広くEPDCを標識し、条件付き遺伝子欠失戦略1のために使用されます。これらの研究は、様々な心外膜の系統の特性評価、およびEPDC運動性および分化の重要なメディエーターの同定につながっています。しかし、蓄積証拠も心外膜は、前駆細胞4,24,25の異種集団であることを示唆しています。このように、心外膜細胞のサブセットのみが与えられたCreドライバを使用して標的化することになります。 かかわらずのCre特異性の全体心外膜を標識するためには、研究室の数が伸長CULを利用してきましたチャーシステムまたはエキソビボ器官培養法を忠実に遺伝的系統マーカー26-28の発現に依存することなく、心外膜細胞を単離するか、標識します。 ex vivoでの移行研究のために、胚の心臓は心外膜EMTの前にし、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アデノウイルス（広告/ GFP）9,18を添加した培地で培養分離されています。このアプローチは、効率的な全体心外膜の標識ではなく、Cre介在組換えによって細胞のサブセットを可能にします。ハート培養物は、その後EPDC 28,29の動員を刺激することがEMTの既知の誘導物質にさらされている。 エクスビボおよびin vivoでの分析EPDCの移行を駆動する詳細なメカニズムを探索するために特に有用なアプローチであるin vitroの心外膜外植片培養物によって補完されています。 ここでは、epicardiのインビトロ研究のための一次心外膜細胞を単離するための方法を記載しますアルEMT、ならびにEPDC運動のex vivo分析のための器官培養系。我々は最近、遺伝的にEPDC 9のアクチンベースの移行を操作するために軸をシグナリングミオカルディン関連転写因子（MRTF）/血清応答因子（SRF）を調節することによって、この方法の有用性と堅牢性を実証しました。我々の知見はEPDC移動を規制するために必要な1つの信号経路を強調しながら、これらの方法はまとめEPDC遊走および分化を調整するメカニズムを解明するのに適しています。また、外植片およびエクスビボ培養系は、心臓再生における治療用途にEPDC動員の新規調節因子を同定するために、機能画面で実施することができます。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Hyclone&amp;nbsp;</td><td>SH3002201</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Hyclone</td><td>SH3003102</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Hyclone</td><td>SH3025301</td><td>M199</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3002802</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gemini&amp;nbsp;</td><td>100-106</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td><td>Corning</td><td>354557</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-well plates</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Equipped with Leica KL300 LED might source</td></tr><tr><td>Confocal miscroscope</td><td>Olympus</td><td>1X81</td><td>Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode&amp;nbsp;</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor beta 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>100-B-001</td><td>TGF-&amp;beta;1</td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor BB</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>220-BB-010</td><td>PDGF-BB</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>15596-026</td><td>Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>DNaseI</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>Life Technologies</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>BioRad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibtor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Goat-anti-rabbit 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-rabbit 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-mouse 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>monoclonal antibody, clone 1A4</td></tr><tr><td>Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td><td>Life Technologies</td><td>MA1-46028</td><td>monoclonal antibody, clone 6F-H2</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO1</td><td>Life Technologies</td><td>40-2200</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Collagen Type 4</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-B</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Disposable mictrotome blades&amp;nbsp;</td><td>Sakura Finetek</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td>positively charged, 25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Disposable base molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

心外膜細胞株の単層心臓、心筋細胞の増殖を刺激するパラクリン因子を提供し、直接開発や病気の際に心臓血管前駆細胞を貢献しています。多くの要因は、心外膜由来細胞（EPDC）の動員に関与してきたが、彼らのその後の移行および分化を支配するメカニズムはよく理解されていません。ここでは、EPDC運動性および分化を研究するための戦略をin vitroで提示し、ex vivoで 。まず、我々はマウス胎児心臓から成長培養によって一次心外膜細胞を得る方法を説明します。我々はまた、器官培養系において標識EPDCの三次元移動を評価するための詳細なプロトコルを導入します。我々は、心外膜でミオカルディン関連転写因子の遺伝子欠失がEPDC移動を減衰させるこれらの技術を使用して証拠を提供します。このアプローチは、EPDCの候補修飾因子を評価するためのプラットフォームとして機能します生物学とは、心臓の修復に有用であるかもしれないEPDC動員の新規な調節因子を同定するための遺伝的または化学的なスクリーニングを開発するために使用することができます。

心外膜は、効率的に外側の位置を利用することと発達可塑性及びEPDCの固有の遊走挙動を利用して成長培養アッセイを用いて単離することができます。マウス胚性心臓を前にダウンコラーゲンコートしたチャンバースライド上の心外膜EMT培養背側にE11.5で分離されている26（ 図1A、B）。外植心臓は収縮していきます。しかし、心外膜はコラーゲンマ...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

心外膜の伸長文化検定と<em&gt; ex vivoで</em&gt;心外膜由来の細胞移動の評価

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K ビュー.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

発生生物学

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

マウス胚心臓から心外膜細胞の体外培養で

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

工学

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

生物学

エレクトロポレーションに基づくマウス心臓細胞のトランスジェネシス

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

著者スポットライト:迅速な遺伝子スクリーニングのための心臓細胞トランスジェネシス

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

心外膜の伸長文化検定と

要約

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有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

マウス胚心臓から心外膜細胞の体外培養で

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

エンフェイスマウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

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大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

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エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

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