This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

以下のプロトコルは、初期の内皮細胞の移動の調査のための手法について説明します。血管内皮細胞の適切な培養は、内皮表現型の適切な増殖および維持を確実にするために、ゼラチンを用いた細胞培養フラスコのプレコーティングを必要とします。 細胞培養フラスコの1プリコート<ol><li> 0.1％の最終濃度になるように0.1 M PBS中のゼラチンを溶かします。 </li><li> （詳細は特定のオートクレーブの手順を参照するための）液体オートクレーブ処理のためのパラメータで溶液をオートクレーブ。 </li><li>無菌の細胞培養フラスコ（T25細胞培養フラスコのため、例えば、少なくとも5 ml）でのオートクレーブ処理ゼラチン溶液の十分な量を加えます。 </li><li>少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO 2を必要としないが、干渉せず）内にフラスコを移し。 </li><li>残りのゼラチン溶液を除去します。その後プレコートフラスコを使用します（参照細胞培養）またはs使用するまで無菌条件下で引き裂きました。 </li></ol>初期の内皮細胞の2細胞培養注：以前に10,11説明したように胚性幹細胞由来の早期内皮細胞（EEC）はPECAM-1陽性細胞分画の磁気活性化細胞選別によって区別マウス胚様体から得ました。 <ol><li> DMEM中でゼラチン被覆細胞培養皿に培養EEC、15％FCS、50 U / mlペニシリン、50 U / mlのストレプトマイシン、200μMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノールおよび1％非必須アミノ酸を補充しました。無菌条件下で細胞を処理します。 37℃、5％CO 2で細胞を培養し、95％の湿度サブコンフルエンス（最大80％）になるまで。 </li><li> 5比：サブ合流点に、1でセルを分割します。注：内皮細胞の剥離は重要なステップです。 <ol><li> RTのACCUTASEで細胞を収穫。 、メディアを取り出し、PBSでリンスし、25単位cm ACCUTASEの1ミリリットルを追加します<sup&gt; 2。 </li><li>細胞が分離するまで、2〜10分間室温でフラスコをインキュベートします。細胞を分散し、所望のアプリケーションに転送します。注：播種した細胞は、37℃のインキュベーターに格納されている場合、それが起こるようACCUTASEの化学的中和は必要ありません。しかし、ACCUTASE活性もFCSを含むDMEMを添加することによって低下させることができます。 </li></ol></li></ol> 3.ボイデンチャンバー注：ボイデンチャンバーアッセイは8μmの孔径を有する光不透明なポリエチレンテレフタレートインサートシステムを使用して実行されます。 <ol><li>プレコートフィルターインサート（細胞培養ウェルの内部その適合は、このようにBoydenチャンバーを作成する）、少なくとも30分間、0.1 M PBSに溶解した0.1％ゼラチンを500μlを加えることにより。 </li><li>細胞は有毒化学物質にさらされる場合は、細胞収穫前に、特定の実験計画に応じて露光します。注：細胞を12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEMに曝露しました24時間。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>収穫EEC計数セルチャンバーを用いて細胞数を決定します。注：自動計数装置を使用することができるが、注意して使用する必要があります。マニュアル細胞計数は、より正確であり、強くお勧めします。 </li><li>ボイデンチャンバーの下室区画に500μlの細胞培養培地を追加します。 </li><li>上室区画にフィルタインサートあたり500μlの細胞培養培地中で正確に10 4 EECを追加します。気泡を除去します。 </li><li>正確に8時間、インキュベーターのフィルタインサートをインキュベートします。 </li><li> PBSで一度洗浄し、細胞固定のための25分間両方の区画に0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを含む培地を交換してください。 0.1 M PBSでフィルターが、少なくとも3回洗浄します。 </li><li>メスで膜を切除。 </li><li>核staininのためにDAPIを含む封入剤を有する2つのガラスカバースリップ間の膜をマウントgです。向きに注意してください。膜の下室側に向かって移動した細胞のみがカウントされていることを確認します。 </li><li> 400Xの倍率で蛍光顕微鏡を用いて、膜の下室側に向かって移動した細胞をカウントします。移動した細胞（ 図1A、1B）との膜孔を混同しないでください。生物学的複製（条件当たり少なくとも3生物学的反復）の合理的な数を調査します。 </li></ol> 4.創傷治癒アッセイ<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置にEECを養う（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）80％コンフルエンスになるまで。重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>滅菌10μlのピペットチップを用いて単層を傷つけ。皿表面上にあまりにも多くの圧力なしそっと先端を押して、分離した細胞を除去するために、0.1 M PBSで二回other.Washに一方の側からスムーズに直線状に移動してください。 </li><li>培養皿に培地の十分な量を追加します。該当する場合は、調査する必要がある化合物を追加します。 注：15 NGを含む1.5 mlの培地/ mlのアルファリノレン酸を添加しました。 </li><li>ライブセルイメージングが可能な顕微鏡下で培養皿をマウントします。 5％CO 2、37℃、加湿雰囲気を確認してください。 注：加湿媒体の蒸発を避けるために特に重要です。 </li><li> 10分間隔で24時間かけてタイムラプス画像を取得します。大きなファイルサイズを計画します。注意：512×512ピクセルの解像度が通常は十分です。しかし、我々は、少なくとも1,024×1,0の画像を使用することをお勧めします24。 </li><li> = 0時間tでのギャップ幅を測定し、tの= 24時間顕微鏡で提供されるソフトウェアの長さツールを使用するか、オープンソースソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。注意：一般に、特定の画像取得及び解析ソフトウェアは、製造業者によって提供されます。そのため、ソフトウェアの使用に関する技術的な詳細については、マニュアルを参照してください。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置で補充したDMEM中に5×10 4 EEC種（ 例えば、24マルチウェルプレート）、37℃で1〜2日間、95％湿度、5％CO 2で細胞を養います。 </li><li>細胞は80にまで成長してきた場合には％コンフルエンス、それぞれの試験物質（例えば、12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEM）の存在下で、メディアと文化の新しいメディアで細胞を除去します。常に（個々のアッセイ系に依存して、24時間）一定時間、37℃での対照細胞（溶媒で処理し、 例えば、エタノール）が挙げられます。 </li><li>生細胞イメージング（37℃、5％CO 2及び95％湿度）が可能な顕微鏡下で培養皿をマウント。事前に定義された間隔で、24時間かけてタイムラプス画像を取得します。 10分間隔で画像を取得します。 </li><li> ImageJのプラグインMTrackJを使用して手動でEECの追跡を行います。視野からランダムに10個のセルを選択し、MTrackJのコマンドを「追加」を使用して時間内にポイント当たりのデータポイントを追加することで、その動きを追跡します。 </li></ol>注：MTrackJは[。Meijering、 Mtrackj「http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/」]で無料で利用可能で、ImageJがご利用できますです。ルで[Rasband、 ImageJの。 &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]。MTrackJプラグインについての詳細なマニュアルは、「http://www.imagescience.org」で入手できます。 ミトコンドリア膜電位の6ライブセルイメージング/評価<ol><li> 80％のコンフルエンスまで適切な細胞培養装置（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）にEECの育成。 重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>該当する場合は、化学物質に細胞を公開します。注：細胞は、24時間12.5 / mlのクロラムブシルに曝露しました。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>テトラメチルDMSO中（TMRM）の10mMストック溶液を調製します。光から保護します。注：ストック溶液は-20℃で保存することができます。 </li><li> （：1,000希釈1）10μMの濃度での作業溶液に細胞培養培地中の原液を希釈します。光から保護しますできるだけ早く使用しています。注：作業溶液は、いくつかの時間（&gt; 1時間）室温で維持することができる、しかし、新鮮なワーキング溶液の調製を強くお勧めします。 </li><li> 1ミリリットルの作業溶液の新鮮な細胞培養培地（ローディング溶液）の2μlを添加します。 </li><li>ローディング溶液で細胞培養培地を交換し、細胞をロードします。 37℃、5％CO 2加湿雰囲気（インキュベーター）で15分間インキュベートします。注意：ほとんどすべての蛍光指示薬は、時間をかけて生細胞によってエクスポートされます。したがって、長期のロードまたは遅延解析を避けます。 </li><li>洗浄することなく、生細胞イメージングに適した顕微鏡下で皿を置きます。重要：蛍光指示薬は、したがって、不要な光の露出を避けるため、光に非常に敏感です。 </li><li>異なる画像間の比較可能性を確保するために取得パラメータを変更せずに画像を取得します。 </li></ol>

<ol>
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B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. 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The authors have nothing to disclose.

有害化学物質への皮膚暴露は、しばしば深刻な創傷治癒障害をもたらします。根底にあるメカニズムは不明な点が多いです。創傷治癒は、異なる位相（止血、炎症、増殖およびリモデリング）で構成され、複雑なプロセスです。細胞移動は、しかし、それは、肉芽組織の形成のために最も重要であり、すべての段階に関与しています。ここで、新しい血管が脈管の脈管形成またはいずれかに?...

細胞遊走は、皮膚損傷後の開発、様々な疾患、および創傷治癒を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要です。 皮膚損傷に続いて、炎症は、損傷または壊死組織および造粒予備創傷閉鎖を駆動し、脈管（小説形成）または血管新生（既存の小胞の出芽）1-3を介して、新しい毛細血管のネットワークの形成を可能にするが削除されます。 vasculo-と血管新生の両方が内皮細胞の移動を必要とします。血管の成長ネットワークは、最終的には角質化を受けるケラチノサイト増殖に酸素と栄養素を運ぶ新しい上皮を形成し、創傷閉鎖を提供するために不可欠です。 内皮細胞の障害の移行は、障害4,5創傷治癒の根底にある原因です。したがって、初期の内皮細胞の遊走を評価する方法がpathophysiolを探索するために必要とされます細胞遊走障害の術とは、治療的介入のための新規の戦略を特定します。 アルキル化剤（ 例えば、硫黄、窒素マスタード）への皮膚暴露は、障害6創傷治癒を引き起こします。このような化合物が原因政治的に不安定な地域や比較的単純な合成における既存の備蓄に強い懸念の理由を20世紀に、いくつかの紛争で化学兵器として使用され、残ってました。硫黄マスタードは、​​最初1822年に合成されたが、SM暴露の分子および臨床病理学を詳細に理解されておらず、SMの暴露のための解毒剤が同定されていません。 いくつかの研究は、理解し、SM暴露後障害、創傷治癒をモデル化するために、その効果を確保することができる潜在的な候補化合物を試験するために行われています。シュミットら （2009）は、MOUにおけるSMと同様の特性を持つアルキル化化合物をクロラムブシルの効果を試験しましたSE胚様体モデルおよび血管形成7の劇的な、時には99％以上の減少を発見しました。この副作用は、ほとんどの生理的条件下で、血管内皮前駆細胞の増殖および移動によって支配され、開発の段階で顕著でした。したがって、これらの細胞は、アルキル化剤に特に敏感であることが確認されました。 Steinritz ら （2010）に、マウス胚様体モデルにおいて、特にSMの毒性を低減する能力について、特に、N-アセチルシステイン（NAC）およびアルファリノレン酸（ALA）中の反応性酸素種（ROS）の捕捉剤をテスト血管形成8を復元します。一時的な保護効果は、過剰なROS形成は、創傷治癒にSMの副作用に貢献する可能性があったことを示し、観察されました。これらの効果は一時的なものであり、2つの候補化合物は、長期8の血管形成および創傷治癒を回復することが可能ではないかもしれません。 HoweveR、これらの実験は、細胞遊走の研究を可能にしました複雑な3Dモデルで行いました。従って、我々は、その後血管形成9の過程において重要な役割を持っているEECの細胞遊走に有益な効果のためにNACとALAをテストしました。 また、細胞極性、細胞遊走に必要とされるという証拠があります。 ROSの形成をもたらすミトコンドリア機能不全は、細胞極性を損なうことが示されたので、有害な細胞の移動に影響を及ぼし得ます。したがって、ミトコンドリア機能に関して、生細胞イメージングを行い、ROSスカベンジャーの効果を調べました。以下のプロトコルは、EEC、Boydenチャンバーアッセイ、細胞トラッキング解析および詳細におけるミトコンドリア機能の評価のためにTMRMの使用を含む創傷治癒アッセイの栽培のための一般的な要件について説明します。 EEC栽培と移行のための実験プロトコルの重要な側面が強調されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

（硫黄および窒素マスタードのようなアルキル化化学兵器を含む）の化学物質への曝露は、創傷治癒障害を含む臨床症状の過多を引き起こします。創傷治癒の生理学的過程は非常に複雑です。いずれかの脈管を通って（小説の形成）または血管新生（既存の血管の出芽） - 肉芽組織の形成は、予備的な創傷閉鎖をもたらし、新たな毛細血管のネットワークを提供し、このプロセスの重要なステップです。 vasculo-と血管新生の両方は、内皮細胞の遊走を向け機能が必要です。このように、初期の内皮細胞（EEC）移行の調査は治癒障害の化学誘起される傷の病態生理を理解し、潜在的な治療的介入のための新規な戦略を特定することが重要です。 我々は、エージェントの露出をアルキル化した後、創傷治癒の障害を評価し、TRのための潜在的な候補化合物を試験しましたeatment。私たちは、このプロトコルで概説技術のセットを使用していました。定量EECのケモキネシスを調査する改変ボイデンチャンバーを説明します。また、質的移行を評価するための軌道分析と組み合わせた創傷治癒アッセイの使用が示されています。最後に、乱れた細胞遊走の基礎となるメカニズムを識別するために、ミトコンドリア膜電位の調査のための蛍光色素TMRMの使用を示します。以下のプロトコルは、EECの調査のために適応されている基本的な手法について説明します。

アルキル化剤への皮膚暴露は、紅斑、水疱形成および創傷治癒障害に関連する皮膚潰瘍を引き起こします。創傷治癒は、内皮細胞の移動に基づいているリンパ管のおよび脈管が必要です。定量的な移行はボイデンチャンバーアッセイを使用して評価することができます。アルキル化剤クロラムブシルのEECの図1Cの露光に示すように、細胞遊走9の有意な減少をもたらしまし...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K ビュー.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

発生生物学

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

心外膜の伸長文化検定と<em&gt; ex vivoで</em&gt;心外膜由来の細胞移動の評価

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...