JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

すべての手順は、オタワ大学の動物実験委員会（動物の倫理プロトコルOHRI-1696）によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。 肺間葉系幹細胞の単離1。 <ol><li> 50ミリリットルチューブに酵素ミックスを調製する：これらの金額は、成体マウスやラットの仔の肺に十分2500 UコラゲナーゼIおよび500 UのDNAse Iを、30 U中性プロテアーゼで重量を量ります。使用するまで4℃で分離し、店舗の日に準備します。 </li><li>ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により13日目に犠牲仔ラット（0.2ミリリットル、65 mg / mlで）。無意識を確立するために、つま先ピンチ反射を使用してください。以下に概説するように、動物の死亡は、胸を開くことによって保証されます。 </li><li>非常に慎重でないという、70％エタノールで動物を噴霧することによって皮膚を消毒し、慎重にダイヤフラムで開始し、吻側側に切断、手術用はさみを使用して、胸郭を開きます肺を損傷します。止血クランプを使用して開いた胸郭を広げ、あるいは胸部へのアクセスを提供するために、胸郭を切り取ります。 </li><li>心を除去することにより、動物を放血。心を削除するには、小さなピンセットで胸腺と心をつかみ、手術用ハサミでこれらを切り取ります。これ以上の血液が切断大動脈と肺動脈から出てくるしなくなるまでその直後、ガーゼで血液を吸収します。 </li><li>次のように胸部から肺を削除します。吻側側の手術用ハサミで気管を切断、その後、小さな鉗子で気管を保持します。そっと胸のうち肺パッケージを引きながら、肺を解放するために胸郭に沿って背側の任意の結合組織を切り取ります。 </li><li>手術用ハサミでダイヤフラムに沿って切断することにより大動脈食道から肺を断ちます。今、肺は胸郭から完全に自由であることをガーゼで優しく残りの血液を除去。 </li><li>シュールで気管や気管支を削除します外科用ハサミ、注意深く冷35 mlの30％クエン酸 - リン酸 - デキストロースアデニン（CPDA-1）抗凝固剤（26.30グラムのクエン酸三ナトリウム二水和物3.27グラムのアスコルビン酸一水和物2.22グラムのモノナトリウムリン酸二水素を含有する50mlチューブに肺葉を転送します血液及び破片を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で使用する前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いて滅菌濾過溶液）; 31.80、G 1 L中のD-グルコース、0.275グラムのアデニン精製H 2 O。 </li><li> 30％CPDA-1 / PBS中で5分間洗浄した後35 mlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）（RT）を含む新たな50mlチューブに肺を転送し、クエン酸を除去するために穏やかに反転させます。 35を含むチューブに移しmlのダルベッコPBS +ナトリウム - ピルビン酸+グルコース（DPBS ++）（RT）。各洗浄工程は、約5分を取る必要があります。 注：塩化カルシウム二水和物132.4ミリグラム、塩化マグネシウム六水和物100mgを、塩化カリウム（無水）200はM：DPBS ++は、商業的に順序付けられたかのように構成することができるが21以下G、1 Lにおけるリン酸二水素カリウム（無水）200mgを、塩化ナトリウム（無水）8,000ミリグラム、リン酸ナトリウム二塩基（無水）1,144.5 mgであり、D-グルコース1000mgの、ピルビン酸ナトリウム36 mgの精製されたH 2 O、pHは7.3。滅菌濾過溶液、使用前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いました。 </li><li> （37℃に予め温めておいた）++ 10mLのDPBSを添加し、溶解するまで穏やかに反転させて酵素ミックスを溶解します。 </li><li>新しい50ミリリットルチューブに肺を転送し、細かくみじん切りまでメスを用いて、管の壁に肺を切ります。いずれかの熱ミキサー、振とう水浴、または水に（しっかりとチューブを閉じ、穏やかに攪拌しながら38℃でインキュベート、（10ミリリットル酵素ミックス/成体マウス/ラットの仔の肺あたりの）組織に酵素ミックスを追加します。定期的な手動攪拌しながら浴）。胎児組織60分、若年/成人組織90-120分、線維性成体組織120-150分：期間は、組織の種類によって異なります。 </li><li>二価の陽イオンワットをキレート化することによって消化を停止i番目の200エチレンジアミン四酢酸μlの（EDTA、0.15 M、pHは7.4。滅菌フィルター使用前に0.22μmのメンブレンフィルターを用いた溶液）。 </li><li> 20 5mlの％ウシ胎児血清（FBS）/ PBSを追加し、新しい50mlチューブに100μmの細胞ストレーナーを介して全体の懸濁液を渡します。 40ミリリットルに総容量をもたらし、10ミリリットルの5％FBS / PBSでチューブとセルストレーナーを洗浄します。 </li><li> 500×gで、室温で5分間遠心します。 </li><li>上清を除去し（ペレットがはっきりと見えるはず）、40ミリリットルの5％FBS / PBS中に再懸濁し、遠心分離工程1.13を繰り返します。 </li><li> 4ミリリットルの5％FBSで再懸濁/ PBS（RT）と慎重の上に3ミリリットルの密度勾配メディアレイヤ（1.073グラム/ cm 3）を15ミリリットルチューブ14インチ良好な中間相を得るためには、単一細胞懸濁液の積層は非常に低速で&gt; 45°の角度で発生することが重要です。 </li><li> 900×gで遠心分離し、20分間、培地（5/10）加速、無減速、19°C。 </li><li>中に存在する細胞を収集10ミリリットル滅菌PBSでそれらをterphaseし、懸濁します。 </li><li> 500×gで、21℃で5分間遠心します。 </li><li>上清を除去し、10mlに細胞ペレットを再懸濁し、予め温め完了L-MSC培地（最小必須培地イーグル、アルファ修正（αMEM）、500ミリリットルαMEM、20％体積/体積あたり2モルのL-グルタミンを補ったFBS 1％容量/容量のペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB. </li><li>遠心分離工程1.18を繰り返します。その後、予熱した新鮮な培養培地10ミリリットルで上清と再懸濁を削除します。 </li><li>この段階での細胞の大部分は、プラスチック接着性ではないので、高密度に血球計又は自動化細胞カウンター板を用いて細胞を数えます。正確なプレーティング密度は、ラット仔の肺からの細胞は1-2 xの播種密度で十分に密であるのに対し、成体マウスの肺の細胞を、10 5細胞/ cm 2で播種され、例えば 、動物種や年齢によって異なります10 4細胞/ cm 2 </sup&gt;。 0.2ミリリットルL-MSCの培養培地/ cm 2とを使用してください 。 </li><li>培養L-MSCを加湿した5％O 2、5％CO 2雰囲気中37℃。 </li><li> PBSで一度すすいだ後培地最初の播種後24時間、続いて3日ごとに変更します。細胞は、起源の動物に応じて、平均して3〜5日かかる80〜90％のコンフルエンスまで培養する必要があります。高い合流は、線維芽細胞への分化を推進していきます。 </li></ol> CD146 +肺間葉系幹細胞の2.選択<ol><li>二次抗体と磁気ビーズのコーティング<ol><li>無菌状態で凍結バイアルコート丸底で10μgの二次抗体/100μlの磁気ビーズの割合でビオチン化二次抗体を用いた磁気ビーズ、滅菌2ミリリットル。予想0.5×10 6細胞あたり10μlの二次抗体を使用し、100μlの磁気ビーズおよび10μg抗体の最小値を使用します。 注：の比率ビーズの体積当たりの使用tibodiesはメーカー間で異なる場合があり、選択のビーズについては、製造元の説明書を参照してください。このプロトコルでは、このプロトコルの最適化に使用されたビーズと抗体について、表1を参照してください。 </li><li>室温で、30回転/分（rpm）で30分間回転サンプルミキサーでインキュベートします。 </li><li> 1.5ミリリットルの滅菌0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）でビーズを再懸濁/ PBSと3ミリリットルへの転送は、丸底チューブ（チューブフローサイトメトリー）。追加の1.5ミリリットル、0.1％BSA / PBSでクライオバイアルをすすぎ、3ミリリットルチューブに移します。 </li><li>適切な磁石上にチューブを置き、すべてのビーズが管の後壁に取り付けられ、溶液が透明になるまで2分待ちます。流出を削除し、3ミリリットルと0.1％BSA / PBSで2回洗って繰り返します。 </li><li>光から保護して4℃で3ミリリットルの0.1％BSA / PBS中のビーズや店舗を、再懸濁します。 5日以内にご使用ください。 </li></ol></li><li> CD146 + L-MSCをラベリング<ol><li>穏やかな非トリプシン溶液を用いてPBSでリンスした後、間葉細胞を収穫。 注：ボリュームは培養フラスコのサイズ（0.2ミリリットル/ cm 2の培地またはPBS）に依存します。 <ol><li>培養培地を除去し、滅菌PBSで細胞を3回すすいでください。 </li><li>穏やかな非トリプシン溶液の適切な量を追加する（ 表1参照）。細胞が分離するまで、 表1の溶液を使用する場合、ほぼ、インキュベーター中で37℃で10分間インキュベートします。 </li><li> L-MSC培地、500×gで5分間遠心分離を添加することによって酵素を不活性化します。 </li></ol></li><li> 0.1％BSA / PBS中で、再懸濁細胞を上清を除去し、血球計または自動細胞カウンターで細胞を数えます。 注：0.1％の体積は、BSA / PBSを培養フラスコの大きさに依存する：5または10ミリリットル、0.1％BSA / PBSを目指します。 </li><li>繰り返し手順2.2.2と3ミリリットル0.1％BSA / PBS（ブロック解除で細胞の専用の量を懸濁特定の結合部位と）生きている細胞を保持します。細胞を氷上に保管してください。 </li><li>一次抗CD146抗体で3ミリリットル丸底チューブを用意し、氷上に保ちます。 注：細胞の専用の量に添加される一次抗体の濃度は、使用される抗体に依存します。提案した抗ラットCD146抗体は 、表1を参照してください 。 </li><li>一次抗体とチューブにステップ2.2.3からの細胞の総容量を追加します。閉じるしっかりと15 rpmで、4℃で回転サンプルミキサーで30分間インキュベートします。 </li><li> 500×gで、4℃で5分間遠心細胞は、3ミリリットル0.1％BSA / PBSで上清と再懸濁細胞ペレットを削除します。繰り返し遠心分離ステップ。 </li><li>セクション2.1の指示に従って調製し、15 rpmで、4℃で回転サンプルミキサーで30分間インキュベートした二次抗体をコーティングしたビーズを含む3ミリリットル溶液中の細胞を再懸濁します。 </li></ol></li><li> CD146 + L-MSCを選択<ol><li>磁石で標識されたCD146 + L-MSCを含むチューブを置きます。陽性細胞は、チューブの背面に描画されます。チューブの移動やビーズに触れることなく、ゆっくりと滅菌パスツールピペット（これらは実験計画に基づいて収集または廃棄することができるのいずれか）と陰性細胞と上清を収穫。 </li><li>磁石からチューブを外し、3ミリリットルの10％BSA / PBSで細胞を懸濁します。ステップ2.3.1で説明した選択手順を繰り返します。 4回（Σ5選択ステップ）。 </li><li>予め温めておいたL-MSCの培養液中にCD146 + L-MSCを再懸濁し、磁石に戻ります。 </li><li>上清を除去し、適切なサイズの培養フラスコ中のL-MSC培地とプレートで再懸濁（0.2ミリリットル/ cm 2）でした。経験則として、同じサイズの培養フラスコ中のプレート細胞は、そこから細胞がビーズを選択する前に解除されました。 CD146 + L-MSCの数、したがって、播種密度、意志ソース動物の年齢、種および株に依存します。常に〜5,000細胞/ cm 2の播種密度を目指します。 注：ビーズは、細胞増殖を妨害しないであろうと、細胞が増殖するにつれて徐々に消えます。 </li></ol></li></ol> 3.凍結細胞<ol><li>以下の凍結培地を使用します、20％FBS、12.5％（0.9％のNaCl中10％ペンタスターチ）の60％ペンタスターチ溶液CPDA-1、2.5％のNaCl（0.9％）、5％ジメチルスルホキシド（DMSO）22。 注：いないすべての成分が使用可能な場合は、5％DMSO、30％FBSおよび65％αMEMを含む溶液は良い選択肢です。 </li><li> 0.5×10 6細胞/ mlで、1ミリリットルそれぞれのクライオバイアル中にアリコートで細胞を再懸濁し、冷凍コンテナを使用して、-80℃でO / Nを凍結します。 </li><li>翌日、液体窒素貯蔵タンクに移します。 </li></ol> 4.解凍細胞<ol><li> 5分間37℃の水浴中で細胞のバイアルを解凍します。 </li><li> 10ミリリットル中に細胞を再懸濁し500×gで、21℃で5分間予熱した培地と遠心分離機。 </li><li>上清を除去し、10ミリリットルの培養液中で細胞ペレットを再懸濁します。通気キャップ細胞培養における種子細胞を0.2ミリリットル/ cm 2の培地中5,000細胞/ cm 2でフラスコを処理し（例えば、75cm 2のフラスコ中で15 ml）を。 </li><li> 5％で培養細胞O 2、5％の収穫および/ ​​または実験的な使用のために80〜90％のコンフルエントになるまでCO 2。オーバー密集度は、分化を誘導します。 5,000細胞/ cm 2で播種したとき、L-MSCは、培養の3~4日以内に80〜90％コンフルエントに達します。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

プライマリL-MSCの単離と文化はより自分の機能や細胞レベルで他の細胞集団との相互作用、および肺の開発、健康と病気におけるその役割を理解するための機会を提供します。これらの細胞の特異的な単一のマーカーの欠如は、in situで 、これらの細胞を研究することはほぼ不可能、これは特に重要です。すべてのプライマリ細胞集団と同様に、1は、これらの細胞が長い彼らは（24<...

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。開発中は、肺を含め、間充織は、発達の手がかりの重要な源であり、レジデントMSCは、このの中心である可能性が高い候補です。また、証拠は、常駐のMSCは、癌1,2および線維症3を含む 、成人病に乱されていることが浮上しています。これらの居住者組織のMSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞4の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。幹細胞抗原-1（SCA-1）組織幹細胞の種々のマーカーとして、マウスにおいて同定された、およびL-MSCの5の単離に用いることができるが、残念ながらあり他の種6にオルソログを知られていません。研究者らは、肺組織または体液のいずれかからL-MSCの単離のための別の単離方法の様々な報告しています。 / CD45 - / - CD90 +細胞7、CD31 - / CD45 - /上皮細胞接着分子（EpCAM） - / SCA-1 +細胞8、多剤耐性トランスポーターこれらは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）CD31について選択に基づいた方法によって異なります細分化した組織13のうちプラスチック接着11,12および移行へのATP結合カセットG（ABCG2）陽性細胞9またはヘキスト33342色素流出10、。 本明細書に提示された方法の利点は数倍です。穏やかな酵素消化および密度勾配14を使用することによって 、人はMSCを含むが、上皮または内皮細胞を排除密度範囲のすべてのセルを取得します。その後のプラスチック接着ステップはmesenchことを保証しますymal細胞が付着し、白血球を除去すること、文化にとどまります。これらの細胞はCD146を発現しないように最も重要なのが、CD146 +選択ステップは、線維芽細胞の排除を可能にします。細胞接着分子CD146の発現を正に多分化と相関し、したがって、間葉細胞集団15-19からの線維芽細胞を取り除くための良好なマーカーです。それは唯一のMSCにもlipofibroblasts 5,20では発現されないので、これは、選択マーカーとしてCD90を使用よりも有利で ​​す。それが細胞に緩やかにあるように、このプロトコルでは、我々は明示的、磁気ビーズ選択を選択している、と全体の手順は無菌状態で行うことができます。成長方法とは対照的に、この分離方法の別の重要な利点は、それが成長法の月以上とは対照的に、6-10日比較的高速であることです。 3〜5日最初の単離後に、間葉系人口は、CD146 + SELEの準備ができています<html> ction。別の3〜5日後、CD146 +細胞を、実験のために使用される準備ができているか、後の使用のために凍結することができます。 MSCは、長期のex vivo培養 19内の線維芽細胞に向かって分化転換として文化の減少時間は、細胞の品質が向上します。最後に、ためのプロトコルの性質のため、消化酵素とインキュベーション時間の選択を調整するだけで適切な抗体を選択することによって、あるいは他の器官系に他の種に​​この方法を適用することができます。 この分離方法の詳細なプロトコルは、以下に与えられ、CD146 +亜集団の単離およびその後の選択の概略図を、それぞれ図1Aおよび 1Bに設けられています。さらに、詳細はこれらの細胞を凍結し、解凍、継代のために含まれています。 広告/ 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; 図1肺間葉細胞（A）の単離およびその後のCD146 +細胞選択（B）の概略分=分。 EDTA =エチレンジアミン四酢酸; 2 番目のAb =二次抗体; α-CD146抗体=一次抗CD146抗体; -ve細胞= CD146陰性細胞; +は= CD146陽性細胞ve細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。また、彼らはおそらく正常な臓器発達における役割を持っている、と疾患における役割、線維性自然との特にそれらを起因しています。これらの居住者組織MSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。ここで説明する分離技術は、肺常駐のMSC（L-のMSC）の複数の特性が適用されます。ラットの屠殺時に、肺を除去し、血液を除去するために複数回洗浄します。メスによる機械的解離後、肺をコラゲナーゼタイプI、中性プロテアーゼおよびDNアーゼI型obtaineのミックスを使用して、2〜3時間のために消化され、D単一細胞懸濁液は、その後の密度勾配媒体（密度1.073グラム/ミリリットル）で洗浄し、積層されています。遠心分離した後、間期からの細胞を洗浄し、培養処理フラスコに播種しました。細胞は、生理的な5％O 2、5％CO 2条件下で4〜7日間培養します。線維芽細胞（CD146 - ）を枯渇させると、CD146 +細胞についてのみ、L-MSCの（CD146 +）、正の選択の人口を確保するために磁気ビーズ選択を介して行われます。要約すると、この手順は確実に、さらにin vitro試験および操作のための主要なL-MSCの集団を生成します。なぜなら、プロトコルの性質上、それは容易に他の実験動物モデルに変換することができます。

MSCは、密度およびプラスチック付着の最も信頼性の高い物理的特性の二つは、L-MSCを含んでいる肺の間葉系細胞画分を得るために、この手順の最初の部分で使用されています。密度勾配相間は、肺間葉系細胞に加えて、単球およびマクロファージが含まれますが、文化の3〜5日に続いてプラスチック接着は肺間葉系細胞が残っていることを保証します。実際、この細?...

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Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

8.3K ビュー.  Ottawa Hospital Research Institute. このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。 

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Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

生物学

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...